水产品中硝基呋喃类代谢物的快速检测方法

案例导入

案例：国家市场监督管理总局2018年8月对江西省水产品抽查发现，多个水产店销售的龙虾、河虾、鲫鱼等水产品检出呋喃妥因、呋喃西林、呋喃它酮、呋喃唑酮代谢物等国家禁用的药物。

讨论：硝基呋喃类有什么危害？如何检测水产品中硝基呋喃类药物？

呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因、呋喃西林属于硝基呋喃类广谱抗生素，广泛应用于畜禽及水产养殖业。硝基呋喃类原型药在生物体内代谢迅速，和蛋白质结合相当稳定，故常利用对其代谢物的检测来反映硝基呋喃类药物的残留状况。《动物性食品中兽药最高残留限量》（原农业部公告第235号）、《兽药地方标准废止目录》（原农业部公告第560号）中规定，硝基呋喃类药物及其代谢物为禁止使用的药物，在动物性食品中均不得检出。硝基呋喃类药物及其代谢物，可引起溶血性贫血、多发性神经炎、眼部损害和急性肝坏死等从而对人类健康造成危害，对人体有致癌、致畸胎副作用。

1.范围

本方法规定了水产品中硝基呋喃类代谢物快速检测方法。

本方法适用鱼肉、虾肉、蟹肉等水产品中呋喃唑酮代谢物（AOZ）、呋喃它酮代谢物（AMOZ）、呋喃西林代谢物（SEM）、呋喃妥因代谢物（AHD）的快速测定。

2.原理

样品中硝基呋喃类代谢物经衍生处理后，其衍生物与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制抗体和检测卡/试纸条中检测线（T线）上硝基呋喃类代谢物-BSA偶联物的免疫反应，从而导致检测线颜色深浅的变化。通过检测线与质控线（C线）颜色深浅比较，对样品基呋喃类代谢物进行定性判定。

3.试剂及材料

除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682-2016规定的二级水。

（1）试剂

盐酸、三水合磷酸氢二钾、氢氧化钠、甲醇、乙醇、乙腈、邻硝基苯甲醛、三羟甲基氨基甲烷、乙酸乙酯、正己烷。

邻硝基苯甲醛溶液（10 mmol/L）：准确称取0.150 g邻硝基苯甲醛，用甲醇溶解并定容至100 mL。

磷酸氢二钾溶液（0.1 mol/L）：准确称取22.822 g三水合磷酸氢二钾，用水溶解并定容至1000 mL。

氢氧化钠溶液（1 mol/L）：准确称取39.996 g氢氧化钠，用水溶解并稀释至1000 mL。

盐酸溶液（1 mol/L）：取10 mL盐酸加入到110 mL水中。

三羟甲基氨基甲烷溶液（10 m mol/L）：准确称取1.211 g三羟甲基氨基甲烷，溶于80 mL水中，加入盐酸（约42 mL）调pH至8.0后用水定容至1 L。

（2）参考物质

硝基呋喃类代谢物参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、分子量见表8-3，纯度≥99%。

表8-3　硝基呋喃类代谢物参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、分子量

（3）标准溶液的配制

标准储备液：分别准确称取适量参考物质（精确至0.0001 g），用乙腈溶解，配制成100 mg/L的标准储备液。-20℃冷冻避光保存，有效期12个月。

混合中间标准溶液：准确移取标准储备液各1 mL于100 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成浓度为1 mg/L的混合中间标准溶液。4℃冷藏避光保存，有效期3个月。

混合标准工作溶液：准确移取0.1 mL混合中间标准溶液于10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成浓度为0.01 m/L的混合标准工作溶液。4℃冷藏避光保存，有效期1个月。

（4）材料

AOZ试剂盒（含胶体金试纸条或检测卡及配套的试剂）；AMOZ试剂盒（含胶体金试纸条或检测卡及配套的试剂）；SEM试剂盒（含胶体金试纸条或检测卡及配套的试剂）；AHD试剂盒（含胶体金试纸条或检测卡及配套的试剂）-固相萃取柱（强阴离子交换型）：规格1 mL，填装量为60 mg。

4.仪器及设备

电子天平：感量分别为0.1 g和0.0001 g，移液枪：10 μL、100 μL、1000 μL、5000 μL，涡旋混合器，均质器，水浴箱，电子天平或手持式天平：感量为0.01 g，离心机，氮吹仪或空气吹干仪，胶体金读数仪（可选），固相萃取装置（可选）。环境条件：温度15～35℃，湿度≤80%。

5.实验方法

（1）试样制备

按照方法要求，称取一定量具有代表性样品可食部分（注：甲壳类，试样制备时须去除头部），用于后续实验。

（2）试样提取和净化

称取适量的勻浆样品（以试剂盒操作说明书要求来定，精确至0.01 g）于50 mL离心管。

①方法一（液液萃取法）。

称取（2±0.05）g均质组织样品于50 mL离心管中，依次加入4 mL去离子水、5 mL 1 mol/L盐酸和0.2 mL 10mmol/L邻硝基苯甲醛溶液，充分振荡3 min；将上述离心管在60℃水浴下孵育60 min；依次加入5 mL 0.1 mol/L磷酸氢二钾溶液，0.4 mL 1 mol/L氢氧化钠溶液，乙酸乙酯6 mL，充分混合3 min，在室温（20～25℃）下4000 r/min离心5 min；移取离心后的上层液体3 mL于5 mL离心管中，60℃下氮气/空气吹干；向吹干的离心管中加入2 mL正己烷，振荡1 min，然后加入0.5 mL 10 mmol/L三羟甲基氨基甲烷溶液，充分混勻30 s，室温下4000 r/min，离心3 min（或静置至明显分层）；下层溶液即为待测液。

②方法二（固相萃取法）。

称取（6±0.05）g均质组织样品于50 mL离心管中，依次加入4 mL去离子水、5 mL 1 mol/L盐酸和0.2 mL 10 m mol/L邻硝基苯甲醛溶液，充分振荡3 min；将上述离心管在60℃水浴下孵育60 min；依次加入5 mL 0.1 mol/L磷酸氢二钾溶液，0.4 mL 1 mol/L氢氧化钠溶液，乙酸乙酯6 mL，充分混合3 min，在室温（20～25℃）下4000 r/min离心5 min；移取离心后的上层液体3 mL于15 mL离心管中，加入10 mL 10%乙酸乙醋—乙醇溶液，上下颠倒混合4～5次，4000 r/min离心1 min（底部会有部分沉淀）。连接好固相萃取装置，并在固相萃取柱上方连接30 mL注射器针筒，将上述上清液全部倒入30 mL针筒中，用手缓慢推压注射器活塞，控制液体流速约1滴/秒，使注射器中的液体全部流过固相萃取柱，再重复推压注射器活塞两次，以尽可能将固相萃取柱中的溶液去除干净。将固相萃取柱下方的接液管更换为洁净的离心管，再向固相萃取柱中加1 mL 10 m mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液。用手缓慢推压注射器活塞，控制液体流速约1滴/秒，使固相萃取柱中的液体全部流至离心管中，离心管中的液体即为待测液。

（3）测定步骤

①试纸条与金标微孔测定步骤。

吸取适量样品待测液于金标微孔中，抽吸5～10次混合均勻，室温（20～25℃）温育5 min，将试纸条吸水海绵端垂直向下插入金标微孔中，温育3～6 min，从微孔中取出试纸条，进行结果判定。

②检测卡测定步骤。

吸取适量样品待测液于检测卡的样品槽中，室温（20～25℃）温育5～10 min，直接进行结果判定。

（4）质控试验

每批样品应同时进行空白试验和加标质控试验。

①空白试验。

称取空白试样，按照以上步骤与样品同法操作。

②加标质控试验。

准确称取空白样品适量（精确至0.01 g）置于50 mL具塞离心管中，加入适量硝基呋喃类代谢物标准工作液，使其浓度为0.5 μg/kg，按照以上步骤与样品同法操作。

6.结果判定

结果的判断也可使用胶体金读数仪判读，读数仪的具体操作与判读原则请参照读数仪的使用说明书。采用目视法对结果进行判读，目视判定示意图如图8-3和图8-4所示。

（1）比色法

①无效。

质控线（C线）不显色，表明不正确操作或试纸条/检测卡无效。

②阳性结果。

检测线（T线）不显色或检测线（T线）颜色比质控线（C线）颜色浅，表明样品中硝基呋喃类代谢物高于方法检测限，判为阳性。

③阴性结果。

检测线（T线）颜色比质控线（C线）颜色深或者检测线（T线）颜色与质控线（C线）颜色相当，表明样品中硝基呋喃类代谢物低于方法检测限或无残留，判为阴性。

图8-3　目视判定示意图（比色法）

（2）消线法(www.xing528.com)

①无效。

质控线（C线）不显色，表明不正确操作或试纸条/检测卡无效。

②阳性结果。

检测线（T线）不显色，表明样品中硝基呋喃类代谢物高于方法检测限，判为阳性。

③阴性结果。

检测线（T线）与质控线（C线）均显色，表明样品中硝基呋喃类代谢物低于方法检测限或无残留，判为阴性。

图8-4　目视判定示意图（消线法）

（3）质控试验要求

空白试验测定结果应为阴性，加标质控试验测定结果应为阳性。

7.结论

当检测结果为阳性时，应对结果进行确证。

8.性能指标

①检测限：AOZ、AMOZ、SEM、AHD均为0.5 μg/kg。

②灵敏度：灵敏度应≥95%

③特异性：特异性应≥95%。

④假阴性率：假阴性率应≤5%。

⑤假阳性率：假阳性率应≤5%。

9.其他

本方法的测定步骤和结果判读也可以根据厂家试剂盒的说明书进行，但应符合或优于本方法规定的性能指标。本标准参比方法为GB/T 21311-2007《动物源性食品中硝基呋喃类药物代谢物残留量检测方法高效液相色谱/串联质谱法》。

目标检测

一、填空题

1.目前针对水发水产品中甲醛的快速检测有____________、____________、_________等方法。

2.孔雀石绿具有潜在的___________、____________、____________作用。

3.水产品中硝基呋喃类代谢物快速检测方法适用鱼肉、虾肉、蟹肉等水产品中___________、____________、____________、___________的快速测定。

二、选择题

1.由于（）可改变虾仁、鱼丸等水产品的色感并防腐作用极好，常常被非法添加在水产品中。

A.甲醛

B.甲醇

C.孔雀石绿

D.磺胺类药物

2.农业部《无公害食品水发水产品》中规定甲醛含量不得大于（）。

A.5 mg/kg

B.10 mg/kg

C.15 mg/kg

D.20 mg/kg

3.实验过程中，需用红色标记笔进行标记，不能用黑色标记笔，因为黑色标记笔含有结晶紫，会对该实验造成污染的是（）。

A.酸价

B.孔雀石绿

C.黄曲霉毒素B1

D.三聚氰胺

4.关于硝基呋喃类，下列叙述哪项是错误的（）。

A.抗菌谱广

B.耐药率低

C.口服吸收好

D.血浆药物浓度低

E.主要药物有呋喃妥因、呋喃唑酮

三、问答题

1.甲醛非法作用于水产品，使其保质期更长，口感更好的原因有哪些？

2.硝基呋喃类有什么危害？

答案及解析

一、填空题

1.AHMT法（比色卡法）、AHMT法（分光光度法）、乙酰丙酮法（分光光度法）

2.致癌、致畸、致突变

3.喃唑酮代谢物（AOZ）、呋喃它酮代谢物（AMOZ）、呋喃西林代谢物（SEM）、呋喃妥因代谢物（AHD）

二、选择题

1.A 2.B 3.B 4.AC

三、简答题：

1.由于甲醛具有凝固蛋白、使蛋白质变性的特点，浸泡过甲醛的水产品表面会显得比较光鲜；组织因蛋白质变性而呈均勻交错的类似橡胶结构，其口感也会得到很大的改善。

2.呋喃类药物及其代谢物，可引起溶血性贫血、多发性神经炎、眼部损害和急性肝坏死等，从而对人类健康造成危害，对人体有致癌、致畸胎副作用。