水产品中的孔雀石绿和结晶紫快速检测技术

案例导入

案例：东莞市市场监督管理局2020年12月对农产品抽查发现，东莞家乐福商业有限公司购进的草鱼和东莞市嘉荣超市有限公司石排利丰店购进的黄骨鱼，孔雀石绿不符合食品安全国家标准规定。

讨论：孔雀石绿有什么危害？如何检测孔雀石绿？

孔雀石绿是有毒的三苯甲烷类化学物，既是染料，也是杀菌和杀寄生虫的化学制剂，可致癌。本品针对鱼体水霉病和鱼卵的水霉病有特效，现市面上还暂无针对水霉病能够短时间解决水霉病的特效药物，这也是这个产品在水产业禁止多年还禁而不止，水产业养殖户铤而走险继续违规使用孔雀石绿的根本原因。其他方面，它也可以用于治疗鰓霉病、小瓜虫病、车轮虫病、指环虫病、斜管虫病、三代虫病和其他一些细菌性疾病。我国农业部已将孔雀石绿列为水产上的禁药，非食用鱼的观赏鱼还可以使用。

研究发现，孔雀石绿进入水生动物体内后，会快速代谢成脂溶性的无色孔雀石绿。孔雀石绿具有潜在的致癌、致畸、致突变的作用，其在养殖业中的使用未得到美国食品药品监督管理局（FDA）的认可；根据欧盟法案2002/675/EC的规定，动物源性食品中孔雀石绿和无色孔雀石绿残留总量限制为2 μg/kg；日本的肯定列表也明确规定在进口水产品中不得检出孔雀石绿残留；我国在农业行业标准NY 5071-2002《无公害食品渔用药物使用准贝》中也将孔雀石绿列为禁用药物。由于没有低廉有效的替代品，孔雀石绿在水产养殖中的使用屡禁不止。

1.范围

本方法规定了水产品及其养殖用水中孔雀石绿和隐色孔雀石绿总量的胶体金免疫层析快速检测方法。本方法适用于鱼肉及养殖用水中孔雀石绿和隐色孔雀石绿总量的快速测定。

2.原理

样品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿经有机试剂提取，吸附剂净化，正己烷除脂后，加入氧化剂将隐色孔雀石绿氧化成为孔雀石绿，经浓缩复溶后，孔雀石绿与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制抗体和检测卡中检测线（T线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。通过检测线与质控线（C线）颜色深浅比较，对样品中孔雀石绿和隐色孔雀石绿总量进行定性判定。

3.试剂及材料

除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682-2016规定的二级水。

（1）试剂

正己烷，乙腈，冰乙酸，盐酸，吐温-20，氯化钠，对甲苯磺酸，无水乙酸钠，盐酸羟胺，无水硫酸钠，中性氧化铝（层析用，100～200目），二氯二氰基苯醌，氯化钾，磷酸二氢钾，十二水合磷酸氢二钠。

饱和氯化钠溶液：称取氯化钠200 g，加水500 mL，超声使其充分溶解。

盐酸轻胺溶液（0.25 g/mL）：称取2.5 g盐酸羟胺，用水溶解并稀释至10 mL，混勻。

乙酸盐缓冲液：称取4.95 g无水乙酸钠及0.95 g对甲苯磺酸溶解于950 mL水中，用冰乙酸调节溶液p H为4.5，用水稀释至1 L，混勻。

二氯二氰基苯醌溶液（0.001 mol/L）：称取0.0227 g二氯二氰基苯醌置于100 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，混勻。4℃避光保存。

复溶液：称取8.00 g氯化钠、0.20 g氯化钾、0.27 g磷酸二氢钾及2.87 g十二水合磷酸氢二钠溶解于900 mL水中，加入0.5 mL吐温-20，混勻，用盐酸调节p H为7.4，用水稀释至1 L，混勻。

（2）参考物质

孔雀石绿、隐色孔雀石绿参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、分子量见表8-2，纯度均≥90%。

表8-2　孔雀石绿、隐色孔雀石绿参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、分子量

（3）标准溶液配制

①孔雀石绿、隐色孔雀石绿标准储备液（1 mg/mL）：精密称取适量孔雀石绿、隐色孔雀石绿参考物质，分别置于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇勻，分别制成浓度为1 mg/mL的孔雀石绿和隐色孔雀石绿标准储备液。-20℃避光保存，有效期1个月。

②孔雀石绿标准中间液A（1 μg/mL）：精密量取孔雀石绿标准储备液（1 mg/mL）0.1 mL，置于100 mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇勻，制成浓度为1 μg/mL的孔雀石绿标准中间液A。临用新制。

③孔雀石绿标准中间液B（100 ng/mL）：精密量取孔雀石绿标准中间液A（1 μg/mL）1 mL，置于10 mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇勻，制成浓度为100 ng/mL的孔雀石绿标准中间液B。临用新制。

④隐色孔雀石绿标准中间液A（1 μg/mL）：精密量取隐色孔雀石绿标准储备液（1 mg/mL）0.1 mL，置于100 mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇勻，制成浓度为1 μg/mL的隐色孔雀石绿标准中间液A。临用新制。

⑤隐色孔雀石绿标准中间液B（100 μg/mL）：精密量取隐色孔雀石绿标准中间液A（1 μg/mL）1 mL，置于10 mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇勻，制成浓度为100ng/mL的隐色孔雀石绿标准中间液B。临用新制。

（4）材料

免疫胶体金试剂盒：适用基质为水产品或养殖用水，金标微孔，试纸条或检测卡。

4.仪器及设备

移液器：200 μL、1 mL和10 mL，涡旋混合器，电子天平或手持式天平：感量为0.01 g，离心机：转速≥4000 r/min，氮吹浓缩仪。环境条件：温度15～35℃，湿度≤80%。

5.实验方法

（1）试样制备

取适量有代表性样品的可食部分或养殖用水，固体样品充分粉碎混勻，液体样品需充分混勻。

（2）试样的提取与净化

①水产品。

准确称取试样2 g（精确至0.01 g）置于15 mL具塞离心管中，用红色油性笔标记，依次加入1 mL饱和氯化钠溶液，0.2 mL盐酸羟胺溶液，2 mL乙酸盐缓冲液及6 mL乙腈，涡旋提取2 min。加入1 g无水硫酸钠，1 g中性氧化招，涡旋混合1 min，以4600 r/min离心5 min。准确移取5 mL上清液于15 mL离心管中，加入1 mL正己烷，充分混勻，以4600 r/min离心1 min。准确移取4 mL下层液于15 mL离心管中，加入100 μL二氯二氰基苯醌溶液，涡旋混勻，反应1 min，于55℃水浴中氮气吹干。精密加入200 μL复溶液，涡旋混合1 min，作为待测液，立即测定。

②养殖用水。

量取试样2 mL置于离心管中，以4600 r/min离心5 min，移取200 μL上清液作为待测液。

（3）测定步骤(www.xing528.com)

①试纸条与金标微孔测定步骤。

吸取全部样品待测液于金标微孔中，抽吸5～10次使混合均勻，室温温育3～5 min，将试纸条吸水海绵端垂直向下插入金标微孔中，温育5～8 min，从微孔中取出试纸条，进行结果判定。

②检测卡与金标微孔测定步骤。

吸取全部样品待测液于金标微孔中，抽吸5～10次使混合均勻，室温温育3～5 min，将金标微孔中全部溶液滴加到检测卡上的加样孔中，温育5～8 min，进行结果判定。

（4）质控试验

每批样品应同时进行空白试验和加标质控试验。

①空白试验。

称取空白试样，按照实验方法与样品同法操作。

②加标质控试验。

A：水产品

准确称取空白试样2 g或适量（精确至0.01 g）置于15 mL具塞离心管中，加人100 μL或适量孔雀石绿标准中间液B（100n g/mL），使孔雀石绿浓度为2 μg/kg，按照实验方法与样品同法操作。

准确称取空白试样2 g或适量（精确至0.01 g）置于15 mL具塞离心管中，加人100 μL或适量隐色孔雀石绿标准中间液B（100 ng/mL），使隐色孔雀石绿浓度为2 μg/kg，按照实验方法与样品同法操作。

B：养殖用水

准确量取空白试样2 mL（精确至0.01 g）置于15 mL具塞离心管中，加人100 μL孔雀石绿标准中间液B（100 ng/mL），使孔雀石绿浓度为2μg/L，按照实验方法与样品同法操作。

6.结果判定

通过对比质控线（C线）和检测线（T线）的颜色深浅进行结果判定。目视判定示意图见图8-2。

（1）无效

质控线（C线）不显色，表明不正确操作或试纸条/检测卡无效。

（2）阳性结果

检测线（T线）不显色或检测线（T线）颜色比质控线（C线）颜色浅，表明样品中孔雀石绿和隐色孔雀石绿总量高于方法检测限，判定为阳性。

图8-2　

图8-2　目视判定示意图

（3）阴性结果

检测线（T线）颜色比质控线（C线）颜色深或者检测线（T线）颜色与质控线（C线）颜色相当，表明样品中孔雀石绿和隐色孔雀石绿总量低于方法检测限，判定为阴性。

（4）质控试验要求

空白试验测定结果应为阴性，加标质控试验测定结果应均为阳性。

7.结论

孔雀石绿和隐色孔雀石绿总量以孔雀石绿计，当检测结果为阳性时，应对结果进行确证。

8.性能指标

①检测限：水产品2 μg/kg，养殖用水2μg/L。

②灵敏度：灵敏度应≥99%。

③特异性：特异性应≥85%。

④假阴性率：假阴性率应≤1%。

⑤假阳性率：假阳性率应≤15%。

9.其他

本方法所述试剂、试剂盒信息及操作步骤是为方法使用者提供方便，在使用本方法时不做限定。方法使用者在使用替代试剂、试剂盒或操作步骤前，须对其进行考察，应满足本方法规定的各项性能指标。

本方法参比标准为GB/T 19857-2005《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》或GB/T 20361-2006《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定高效液相色谱荧光检测法》（包括所有的修改单）。

本方法使用试剂盒可能与结晶紫和隐色结晶紫存在交叉反应，当结果判定为阳性时应对结果进行确证。