快速检测食品中黄曲霉毒素M1

案例导入

案例：2011年，国家质检总局公布了对200种液体乳产品质量的抽查结果。抽查发现2家牛奶产品中黄曲霉毒素M1项目不合格，主因来源于牛的饲料，该批次全部产品进行了封存和销毁，企业向全国消费者郑重致歉。

那么什么是黄曲霉毒素M1？黄曲霉毒素M1有什么危害？如何采用快速检测方法检测黄曲霉毒素M1？

黄曲霉毒素M1（Aflatoxin M1，缩写AFM1），其基本结构为一个二呋喃环的氧杂萘邻酮。分子式为C17H22O7，MW：328，熔点：299℃，形状为长方形片状，无色结晶。属于黄曲霉毒素（Aflatoxins）一类结构相似的化合物的一种，该类毒素是由常见的黄曲霉菌（Asperillus Flavus）和寄生曲霉菌（Asperillus Parasiticus）产生的代谢产物，其中黄曲霉毒素B1是最主要的一种毒素，哺乳类动物摄入被AFB1污染的饲料或食品后，在体内的肝微粒体单氧化酶系催化下，通过细胞色素P-448调节作用，AFB1末端呋喃环C-10被羟化而生成AFM1，AFM1毒性主要表现在致癌性和致突变性，生理学致癌机制的研究表明：AFM1的远端呋喃环环氧结构与体内DNA嘌呤残基共价结合，从而造成DNA的某些损伤，引起DNA结构和功能的改变，产生癌变，与AFB1的致癌性基本相似，但毒性低于AFB1，然而与氰化钾和砒霜相比，仍属特别剧毒物质，为强致癌剂。

因此针对食品特别是乳制品，制定严格的AFM1限量标准就尤为重要，一方面能最大限度地控制人体对AFM1的摄入量，减轻对人体的危害；另一方面也能加强乳及乳制品生产企业品质管理，保证向消费者提供营养安全的食品。

1.范围

本标准规定了牛乳中黄曲霉毒素M1的双流向酶联免疫快速定性检测方法。本标准适用于生牛乳、巴氏杀菌乳、UHT灭菌乳和乳粉中黄曲霉毒素M1的测定。本标准的方法检出限为0.5 μg/kg。

2.原理

本方法采用竞争抑制免疫层析原理。样品中的黄曲霉毒素M1与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制抗体和试纸条或检测卡中检测线（T线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。通过检测线与质控线（C线）颜色深浅比较，对样品中黄曲霉毒素M1进行定性判定。

3.试剂及材料

①甲醇。

②黄曲霉毒素M1参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、分子量见表6-3，纯度≥90%。

表6-3　黄曲霉素M1参考物质中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、分子量

③黄曲霉毒素M1标准储备液（100 μg/mL）：精密称取适量黄曲霉毒素M1标准品，在烧杯中溶解并转移至10 mL容量瓶中，其中利用甲醇溶解并稀释至刻度，摇勻，制成浓度为100 μg/mL的黄曲霉毒素M1标准储备液；或可直接购买黄曲霉毒素M1标准储备液。-20℃避光保存备用，有效期3个月。

④黄曲霉毒素M1标准中间液（100 ng/mL）：精密量取黄曲霉毒素M1标准储备液（100 μg/mL）0.1 mL，置100 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇勻，制成浓度为100 ng/mL的黄曲霉毒素M1标准中间液。临用新制。

⑤材料。

黄曲霉毒素M1胶体金免疫层析试剂盒，适用基质为液体乳、金标微孔（含胶体金标记的特异性抗体）、试纸条或检测卡。

4.仪器及设备

移液器：100 μL、200 μL和500 μL；涡旋混合器；电子天平：感量为0.01 g。

环境条件：温度15～35℃，湿度＜80%。

5.分析步骤

（1）试样制备

取适量有代表性样品充分混勻。

（2）试样提取和净化

以液体乳为基质的样品可直接上样检测或根据产品说明书稀释后检测。

（3）测定步骤

①试纸条与金标微孔测定步骤。

吸取100～200 μL样品待测液于金标微孔中，抽吸5～10次使混合均匀，不要有气泡，室温温育3～5 min（据配套说明书进行避光操作），将检测试纸条样品端垂直向下插入金标微孔中，温育5～10 min，从微孔中取出试纸条，进行结果判定。

②检测卡与金标微孔测定步骤。

吸取100～200 μL样品待测液于金标微孔中，抽吸5～10次使混合均匀，不要有气泡，室温温育3～5 min（据配套说明书进行避光操作），将金标微孔中全部溶液滴加到检测卡上的加样孔中，温育5～10 min，进行结果判定。

6.质控试验

每批样品应同时进行空白试验和加标质控试验。

①空白试验。(www.xing528.com)

称取空白试样，与样品同法操作。

②加标质控试验。

准确称取空白试样100 g（精确至0.01 g）置于100 mL玻璃溶液瓶中，加入500 μL黄曲霉毒素M1标准中间液（100 ng/mL），使试样黄曲霉毒素M1含量浓度为0.5 μg/kg，然后与样品同法操作。

7.结果判定

通过对比质控线（C线）和检测线（T线）的颜色深浅进行结果判定。目视结果判读如图6-5。

图6-5　目视判定示意图

（1）无效

质控线（C线）不显色，表明不正确操作或试纸条检测卡无效。

（2）阳性结果

①消线法。

检测线（T线）不显色，质控线（C线）显色，表明样品中黄曲霉毒素M1含量高于方法检测限，判定为阳性。

②比色法。

检测线（T线）颜色比质控线（C线）颜色浅或几乎不显色，表明样品中黄曲霉毒素Ml含量高于方法检测限，判定为阳性。

（3）阴性结果

①消线法。

检测线（T线）、质控线（C线）均显色，表明样品中黄曲霉毒素mL含量低于方法检测限，判定为阴性。

②比色法。

检测线（T线）颜色比质控线（C线）颜色深或者检测线（T线）颜色与质控线（C线）颜色相当，表明样品中黄曲霉毒素mL含量低于方法检测限，判定为阴性。

（4）质控试验要求

空白试验测定结果应为阴性，加标质控试验测定结果应为阳性。

8.结论

黄曲霉毒素mL与其他几种黄曲霉毒素（黄曲霉毒素Bl、黄曲霉毒素M2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2）有交叉，当检测结果为阳性时，应对黄曲霉毒素mL结果进行确证。

9.性能指标

①检测限：0.5 μg/kg；

②灵敏度：灵敏度应≥99%；

③特异性：特异性应≥90%；

④假阴性率：假阴性率应≤l%；

⑤假阳性率：假阳性率应≤l0%。

l0.其他

本方法所述试剂、试剂盒信息及操作步骤是为方法使用者提供方便，在使用本方法时不做限定。方法使用者应使用经过验证的满足本方法规定的各项性能指标的试剂、试剂盒。

本方法参比标准为GB 5009.24-20l6《食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素M族的测定》。

本方法使用试剂盒可能与黄曲霉毒素Bl、黄曲霉毒素M2、黄曲霉毒素Gl和黄曲霉毒素G2存在交叉反应，当结果判定为阳性时，应采用实验室仪器方法GB 5009.24-20l6《食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素M族的测定》对黄曲霉毒素mL结果进行确证。