食品中三聚氰胺快速检测技术

案例导入

案例：2008年中国奶制品污染事件，事故起因是很多食用三鹿集团生产的奶粉的婴儿被发现患有肾结石，随后在其奶粉中发现化工原料三聚氰胺。截至2008年9月21日，因使用婴幼儿奶粉而接受门诊治疗咨询且已康复的婴幼儿累计39965人，正在住院的有12892人，此前已治愈出院1579人，死亡4人，另截至9月25日，香港有5人、澳门有1人确诊患病。

那么什么是三聚氰胺？三聚氰胺究竟有什么危害？如何采用快速检测方法检测三聚氰胺？

三聚氰胺（Melamine），俗称蜜胺、蛋白精，分子式为C3H4N6，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，被用作化工原料。三聚氰胺性状为纯白色单斜棱晶体，无味。目前三聚氰胺被认为毒性轻微，大鼠口服的半数致死量大于3 g/kg体重。据科学家做过的实验发现：将大剂量的三聚氰胺饲喂给大鼠、兔和狗后，没有观察到明显的中毒现象。动物长期摄入三聚氰胺会造成生殖、泌尿系统的损害，膀胱、肾部结石，并可进一步诱发膀胱癌。1994年国际化学品安全规划署和欧洲联盟委员会合编的《国际化学品安全手册》第三卷和国际化学品安全卡片也只说明：长期或反复大量摄入三聚氰胺可能对肾与膀胱产生影响，导致产生结石。

一、胶体金免疫层析法

1.原理

本方法采用竞争抑制免疫层析原理。样品中的三聚氰胺与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制抗体和试纸条或检测卡中检测线（T线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。通过检测线与质控线（C线）颜色深浅比较，对样品中三聚氰胺进行定性判定。

2.试剂及材料

除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682-2016规定的二级水。

①甲醇。

②三羟甲基氨基甲烷（Tris）。

③1 mol/L盐酸：移取83 mL浓盐酸，加入900 mL水中，定容至1 L。

④甲醇水溶液：准确量取50 mL甲醇和50 mL水，混勻后备用。

⑤稀释液：准确称取6.05 g Tris和8.5 g 1 mol/L盐酸，加水定容至1 L，混勻后备用。

⑥参考物质。

参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、分子量见表6-2，纯度≥99%。

表6-2　三聚氰胺参考物质中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、分子量

⑦标准溶液的配制。

三聚氰胺标准储备液（1000 μg/mL）：精密称取适量三聚氰胺标准品，在烧杯中溶解并转移至10 mL容量瓶中，其中利用甲醇水溶液溶解并稀释至刻度，摇勻，制成浓度为1000 μg/mL的三聚氰胺标准储备液；或可直接购三聚氰胺标准储备液。4℃避光保存备用，有效期3个月。

⑧三聚氰胺胶体金免疫层析试剂盒。

A.金标微孔（含胶体金标记的特异性抗体）。

B.试纸条或检测卡。

3.仪器及设备

①移液器：200 μL、1000 μL和5 mL。

②涡旋混合器。

③电子天平：感量为0.01 g。

④环境条件：温度15～35℃，湿度≤80%。

4.分析步骤

（1）试样制备

取适量有代表性样品充分混勻。

（2）试样提取

准确称取样品0.5 g于离心管中，加入5 mL稀释液，涡旋混勻提取5 min，即得待测液。

注：试样提取过程可按照试剂盒说明书，不做限定。

（3）测定步骤

①试纸条与金标微孔测定步骤。

吸取150～200 μL样品待测液于金标微孔中，抽吸5～10次使混合均勻，不要有气泡，40℃温育3 min，将检测试纸条样品端垂直向下插入金标微孔中，40℃温育5 min，从微孔中取出试纸条，进行结果判定。

②检测卡测定步骤。

吸取150～200 μL样品待测液于检测卡加样孔中，室温反应3～5 min，进行结果判定。

（4）质控试验

每批样品应同时进行空白试验和加标质控试验。

①空白试验。

称取空白试样，与样品同法操作。

②加标质控试验。

准确称取空白试样100 g（精确至0.01 g）置于100 mL玻璃溶液瓶中，加入250 μL三聚氰胺标准溶液（1000 μL/mL），使试样中三聚氰胺浓度为2.5 mg/kg，与样品同法操作。

注：可参考标准品的说明书配置操作。

5.结果判定

通过对比质控线（C线）和检测线（T线）的颜色深浅进行结果判定。目视结果判读如图6-3。

图6-3　试纸条/检测卡目视判定示意图

（1）无效

质控线（C线）不显色，表明不正确操作或试纸条/检测卡无效。

（2）阳性结果

①消线法。

检测线（T线）不显色，质控线（C线）显色，表明样品中三聚氰胺含量高于方法检测限，判定为阳性（如图6-3试纸条/检测卡目视判定示意图）。

②比色法。

检测线（T线）颜色比质控线（C线）颜色浅或几乎不显色，表明样品中三聚氰胺含量高于方法检测限，判定为阳性（如图6-3试纸条/检测卡目视判定示意图）。

（3）阴性结果

①消线法。

检测线（T线）、质控线（C线）均显色，表明样品中三聚氰胺含量低于方法检测限，判定为阴性（如图6-3试纸条/检测卡目视判定示意图）。

②比色法。

检测线（T线）颜色比质控线（C线）颜色深或者检测线（T线）颜色与质控线（C线）颜色相当，表明样品中三聚氰胺含量低于方法检测限，判定为阴性（如图6-3试纸条/检测卡目视判定示意图）。

（4）质控试验

空白试验测定结果应为阴性，加标质控试验测定结果应为阳性。

（5）读数仪测定

按读数仪说明书要求操作直接读取并进行结果判定。

6.结论

三聚氰胺与灭蝇胺有交叉反应，当检测结果为阳性时，应对三聚氰胺结果进行确证。(www.xing528.com)

7.性能指标

①检测限：2.5 mg/kg。

②灵敏度：灵敏度应≤99%

③特异性：特异性应≥85%。

④假阴性率：假阴性率应≤1%。

⑤假阳性率：假阳性率应≤15%。

8.其他

本方法所述试剂、试剂盒信息及操作步骤是为方法使用者提供方便，在使用本方法时不做限定，可根据试剂盒说明书进行操作。方法使用者应使用经过验证的满足本方法规定的各项性能指标的试剂、试剂盒。

本方法参比标准为GB/T 22388-2008《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》。

本方法使用试剂盒可能与灭蝇胺存在交叉反应，当结果判定为阳性时，应采用实验室仪器方法GB/T 22388-2008《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》对三聚氰胺结果进行确证。

二、液体乳中三聚氰胺的快速检测（拉曼光谱法）

1.范围

本方法规定了液体乳制品中三聚氰胺快速测定方法。

本方法适用于生鲜乳、灭菌乳、巴氏杀菌乳、调制乳和发酵乳等液态乳制品中三聚氰胺含量的快速测定。

2.原理

样品经沉淀、溶剂提取，加表面增强拉曼试剂对信号增强，进行拉曼光谱扫描。以（704±10）cm-1处的拉曼特征峰作为三聚氰胺定量基准峰，以（925±10）cm-1或类似基质中稳定存在的拉曼峰为参比峰，根据三聚氰胺峰与参比峰的相对强度对三聚氰胺的浓度绘制标准曲线，内置仪器内进行判别。

3.试剂及材料

①三氯乙酸。

②三氯乙酸溶液（5%）：准确称取三氯乙酸50 g于1 L容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混勻后备用。

③表面增强试剂：金或银纳米粒子溶胶，或相当者。

④纳米金溶胶：取100 mL 0.01%氯金酸（AuCl3·HC1·4H20）水溶液加热至沸腾，剧烈搅拌下准确加入1.0 mL 1%柠檬酸三钠（Na3C6H507）水溶液，金黄色的氯金酸水溶液在2 min内变为红色，继续煮沸15 min，冷却后用蒸馏水补加到100 mL。增强试剂配制用水为GB/T 6682-2016规定的一级水。

⑤纳米银溶胶：取200 mL 1.0mmol/L硝酸银（AgN03）水溶液加热沸腾，剧烈搅拌下逐滴准确滴加5.0 mL 1%柠檬酸三钠（Na3C6H507）水溶液，持续煮沸1 h，溶液变为灰绿色，冷却后用蒸馏水补加到200 mL。增强试剂配制用水为GB/T 6682-2016规定的一级水。

⑥促凝剂。

金溶胶的促凝剂：称取5.85 g氯化钠，溶于100 mL水中，摇勻，备用，或配制成其他相当的无机盐溶液。

银溶胶的促凝剂：称取5.85 g氯化钠和2 g氢氧化钠，溶于100 mL水中，摇勻，备用，或制成其他相当的无机盐溶液。

⑦参考物质。

三聚氰胺参考物质中文名称、英文名称、CAS号、分子式、分子量见表6-2，纯度≥99%。

⑧标准溶液配制。

三聚氰胺标准工作液（500 μg/mL）：精密称取三聚氰胺标准品适量，在烧杯中溶解并转移至100 mL容量瓶中，其中利用水溶解并稀释至刻度，摇勻，制成浓度为500 μg/mL的标准储备液。4℃避光保存，有效期1个月。

4.仪器及设备

①便携式拉曼光谱仪。

②稳频激光光源：发射波长为（785±1）nm，线宽＜0.1nm，能量≥250mW；光谱分辨率≤15 cm-1；光谱响应范围500～2000 cm-1，或大于该响应范围。

③移液器：200 μL、1 mL和5 mL。

④涡旋振荡器。

⑤离心机：转速≥6000 r/min。

⑥电子天平：感量为0.01 g。

⑦塑料具塞离心管：2 mL。

5.分析步骤

（1）试样的提取

取0.5 g样品加到2 mL离心管中，再加入1 mL 5%三氯乙酸溶液，涡旋30s混勻；放入离心机，以不低于6000 r/min转速离心1 min；上清液备用。

（2）测定步骤

拉曼光谱仪器参考条件：激光能量≥250mW，数据采集时间≥2s。在仪器样品池中依次加入100 μL促凝剂，100 μL表面增强试剂，50 μL样品，快速摇晃均匀，等待20s检测（检测需在样品加入后1 min内完成）。

（3）质控试验

每批样品应同时进行空白试验和加标质控试验。

①空白试验。

称取空白试样，与样品同法操作。

②加标质控试验。

准确称取空白试样10 g置于15 mL具塞离心管中，加入50 μL三聚氰胺标准工作液（500 μg/mL），使三聚氰胺浓度为2.5 mg/kg，与样品同法操作。

6.结果判定

仪器软件将测试结果与标准谱图库中的三聚氰胺进行匹配计算，根据谱图（704±10）cm-1处特征拉曼光谱及内置校准曲线，对样品中的三聚氰胺进行结果判定：显示测试结果并判定阴性或阳性。阴性代表该样品不含有三聚氰胺或低于2.5 mg/kg，阳性则代表该样品含有三聚氰胺且大于等于2.5 mg/kg。液态乳表面增强拉曼光谱图参见图6-4。

图6-4　液态乳表面增强拉曼光谱图

质控试验要求：

空白试样测定结果应为阴性，加标质控样品测定结果应为阳性。

7.性能指标

①检测限：2.5 mg/kg。

②灵敏度：灵敏度应≥99%。

③特异性：特异性应≥85%。

④假阴性率：假阴性率应≤1%。

⑤假阳性率：假阳性率≤15%。

8.确证

本方法为初筛方法，当检测结果为阳性时，应对结果进行确证。

9.其他

本方法所述纳米表面增强试剂、促凝剂信息及操作步骤是为方法使用者提供方便，在使用本方法时不做限定。方法使用者在使用替代试剂或操作步骤前，须对其进行考察，应满足本方法规定的各项性能指标。

本方法参比标准为GB/T 22388-2008《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》。