食品快速检测技术：牛乳中青霉素检测

案例导入

案例：青霉素是一种高效广谱抗生素类药物，广泛用于治疗奶牛乳腺炎，由于频繁地超剂量使用，造成其在牛奶等动物源食品的残留，严重影响食用者的身体健康。人对青霉素过敏反应较常见，包括荨麻瘆等各类皮瘆、白细胞减少、间质性肾炎、哮喘发作等和血清病型反应；过敏性休克偶见，一旦发生，必须就地抢救，予以保持气道畅通、吸氧及使用肾上腺素、糖皮质激素等治疗措施。

那么如何采用快速检测方法检测牛乳中的青霉素？

随着国家对食品安全问题的关注和部分乳制品企业无抗奶目标的提出，抗生素残留问题成为影响乳制品安全的重要因素之一。目前，青霉素作为β-内酰胺类药物是治疗牛乳腺炎的首选药物，是牛奶中最常见的残留抗生素。试验表明，用抗生素治疗后的奶牛，其挤出的牛奶5天内都有抗生素残留。尤其是使用乳房灌注法治疗乳腺炎时，易造成牛奶中抗生素残留。休药期的长短是根据药物进入动物体内吸收、分布、转化、排泄与消除过程的快慢而制定的。即使同一种药物，用法不同休药期长短也不相同，休药期的长短还与用药剂量有很大关系。饲养者使用标有休药期的抗生素药物及含抗生素药物饲料添加剂后，未按规定遵守休药期，或是使用含抗生素药物饲料添加剂后，未按规定遵守休药期就将产品出售，这是造成抗生素药物残留量超标的主要原因之一，下面来介绍一下牛乳中青霉素的快速检测技术。

1.范围

适用于牛乳中青霉素的残留常规快速筛选检测，检测限为1.0μg/L。

2.原理

本试验是以抗原抗体反应为基础。用兔抗OVA抗体包被微量反应板，青霉素-OVA偶联物与之特异结合，鼠抗青霉素抗体、青霉素标准品或样品加在一起，游离青霉素与青霉素-OVA偶联物中的青霉素竞争青霉素抗体，没有与青霉素-OVA偶联物结合的青霉素抗体被洗去，加入羊抗鼠lgG作用并洗板，加过氧化氢尿素和四甲基联苯胺溶液作用一定时间，结的酶结合物作用于底物使无色的四甲基联苯胺转化为蓝绿色的产物，加人终止液后变为金黄色，用波长450 nm（双波长时最适参考波长≥600 nm）酶标仪进行检测，吸光值与样品中青霉素含量成反比。

3.试剂及材料

除特殊注明外，本法所用试剂均由试剂盒厂商提供，水为符合GB/T 6682-2016规定的二级水。

①0.36 mol/L亚铁氰化钾溶液。

②1.04 mol/L硫酸锌溶液。

③缓冲溶液，为磷酸盐缓冲液（PBS）。

④洗板液，为磷酸盐一吐温缓冲液（PBST）。

⑤青霉素系列标准溶液，使用前按说明书要求用缓冲溶液稀释至终浓度0 ng/L、40 ng/L、200 ng/L、1000 ng/L、5000 ng/L、25000 ng/L、125000 ng/L。

⑥青霉素-OVA偶联物，使用前根据需用量按说明书要求用缓冲溶液作一定倍数稀释。

⑦抗青霉素特异性抗体，使用前将瓶中浓缩的抗青霉素抗体仔细摇勻，根据实验所需用量吸取，按要求用缓冲溶液进行稀释。

⑧酶标记二抗，使用前根据需用量按说明书要求用缓冲溶液作一定倍数稀释。

⑨底物缓冲溶液A，为四甲基联苯胺（TMB）溶液。

⑩底物缓冲溶液B，为过氧化氢尿素柠檬酸溶液。

⑪终止溶液，为2 mol/L硫酸溶液。

⑫酶标板，为微量反应板，已经被抗体包被和封闭，沿剪切线将铝箔袋剪开，取出所需反应板固定于反应板架上，没有使用的微量反应板与试剂盒提供的干燥剂一并用铝箔袋封好，置2～8℃冷藏保存。

4.仪器及设备

酶标读数仪（配备450 nm滤光片）、离心机、微型振荡器、恒温水浴箱、微量移液器。

5.制样

（1）样品要求

制样宜用新鲜牛乳；若不能立即制样，应贮于不高于4℃条件，时间不应超过2 d。

（2）样品预处理(www.xing528.com)

取10 mL供试牛乳进行处理。

①10℃3500 r/min离心10 min，弃去上层脂肪层。

②取5 mL去脂牛乳，加入0.36 mol/L亚铁氰化钾溶液150 μL，摇勻后再加入1.04 mol/L硫酸锌溶液150 μL，迅速摇勻。

③15℃3500 r/min离心10 min。若离心后的上清液仍显混浊，应按上步骤再次处理。

④取上清液，用缓冲溶液将其作1：1稀释（1份上清液+1份缓冲溶液）为处理试样，取50 μL用于测定。

6.测定步骤

①将试剂盒取出放置19～25℃1～2 h。按每个标准溶液和试样做不少于2个重复测定，计算所需酶标板条的数量，插入框架。

②向微孔中各加入用缓冲液稀释的青霉素-OVA偶联物50 μL；分别加入青霉素系列标准溶液50 μL；加入经稀释的抗青霉素特异性抗体50 μL（空白对照孔不加，以等量缓冲溶液代替）。用封口膜封好，19～25℃孵育60 min。

③倒掉反应孔的液体，在吸水纸上倒扣酶标板3次，并用吸水纸将酶标板四周吸干，以确保反应孔中不留残余液体；向每孔中加入洗板液，3 min后倒掉孔中液体，重复洗板过程2次。

④向微孔中加已经稀释的酶标羊抗鼠二抗100 μL，在微型震荡器上混勻，用封口膜封好，19～25℃孵育30 min。倒出孔内液体，按③中洗板3次。

⑤每孔加50 μL底物缓冲液A和50 μL底物缓冲液B，在微型振荡器上充分混匀（也可先将底物缓冲液A和B等量混匀，每孔加100 μL），19～25℃避光孵育15 min。

⑥每孔加100 μL终止液，混勻。

⑦在酶标读数仪上以450n m滤光片，空白对照孔调零，测定其他各孔的吸光度值，30 min内完成读数。

7.计算

百分吸光度值（%OD）按下式计算：

式中B——标准溶液或处理试样孔的平均吸光度值；

B0——零浓度的标准溶液孔平均吸光度值。

以X轴为标准溶液中青霉素浓度（ng/L）的自然对数，Y轴为百分吸光度值，在半对数坐标纸上绘制标准曲线图。

由标准曲线上查出处理试样中青霉素的浓度（ng/L），或用专业计算机软件求出处理试样中青霉素的浓度。

处理试样中青霉素浓度乘以稀释系数2.12，得到被检牛乳样品中青霉素浓度（ng/L）。（注：制样时去脂牛乳5 mL中加入0.36 mol/L亚铁氰化钾溶液150 μL和1.04 mol/L硫酸锌溶液150 μL，离心处理后取上清液用缓冲溶液作1：1稀释，经换算得到稀释系数为2.12）。

8.检测方法的灵敏度、准确度、精密度

（1）灵敏度

本方法在牛乳中青霉素的检测限为1.0μg/L。

（2）准确度

本方法在牛乳中添加青霉素1.0～1000.0（JL浓度水平上的回收率为60%～120P。

（3）精密度

本方法批内变异系数CV≤30%，批间变异系数CV≤45%。