牛乳中大肠菌群的快速检测技术

案例导入

案例：《消费者报道》整理了国家市场监督管理总局（原国家食品药品监督管理总局）收录的自2014年1月～2019年8月对牛奶的质量抽检情况。结果显示，监管部门近5年共抽检了3727批次牛奶（包括灭菌乳、调制乳、巴氏灭菌乳等），其中3675批次合格，合格率为98.6%。抽检结果显示，微生物超标是不合格牛奶的主要原因，其中大肠菌群（26次），占不合格比例的44.1%。

那么大肠菌群为何会超标，其原因是什么？如何采用快速检测方法检测大肠菌群呢？

大肠菌群普遍存在于我们生活的环境中，它的耐忍力比一般致病菌强。大肠菌群由很多不同类型的细菌组成，有的对人体无害，少数存在致病性。消费者食用大肠菌群超标的牛奶可能会引起急性、呕吐、腹泻等症状。而牛奶含丰富的蛋白质及乳脂，是微生物生长繁衍的温床。如果外界污染，或者在生产、包装过程中通过人工操作或不洁的包装容器等均可能往牛奶中带入“细菌”。因此，需加强牛奶生产加工各个环节的质量控制，而大肠菌群快速检测技术则显得尤为重要。

1.范围

大肠菌群纸片法与国标法相比，将国标法中比较繁杂的实验操作简化为一步，检测时间也由一个星期左右缩短至十几个小时，且省去了制备培养基和清洗器皿等操作流程，非常适合于生产企业自检和卫生检测部门使用。在计数方面，与传统的MPN法相比，更加准确。

2.原理

快检纸片法是依据大肠菌群细菌生长发育时分解乳糖产酸，同时产生脱氢酶脱氢，氢与无色氯化三苯四氮唑（TTC）作用形成红色三苯甲月替（TTF）使菌落（菌苔）变红的原理，将一定量的乳糖、指示剂（TTC）、溴甲酚紫、蛋白胨等吸附在特定面积的无菌滤纸上，大肠菌群细菌通过上述两种指示剂显示出发酵乳糖产酸纸片变黄和形成红色斑点（红晕）的固有特性。

3.检测步骤

（1）样品处理

取样品25 mL（g）放入含有225 mL灭菌磷酸缓冲液稀释液（或生理盐水）的取样罐或均质杯内，制成1：10的样品匀液，用1 mL灭菌吸管吸取1：10样品匀液1 mL，注入含有9 mL稀释液的试管内，振摇后成为1：100的样品匀液，依次往下稀释。

（2）接种

一般样品选1～2个稀释度进行检测，含菌量少的液体样品可直接吸取原液进行检测。将大肠菌群测试片置于平坦实验台面，揭开上层膜，用无菌吸管吸取1 mL样品匀液慢慢均匀地滴加到纸片上，然后再将上层膜缓慢盖下，静10 s左右使培养基凝固，每个稀释度接种两片。同时做一片空白阴性对照。

（3）培养(www.xing528.com)

将测试片叠在一起放回原自封袋中并封口，透明面朝上水平置于恒温培养箱内，堆叠片数不超过12片。培养温度为（36±1）℃，培养15～24 h。

4.结果判定

在测试纸片培养基上显红色斑点，周围有黄晕并且有气泡者为大肠菌群阳性菌落。

5.计数原则及报告方式

①选择菌落数在15～150个之间的纸片进行计数。

②若两个稀释度的菌落数均在15～150之间，取其平均菌落数乘以稀释倍数，即为每毫升（或每克）样品中大肠菌群菌落形成单位数。

③如果所有稀释度的测试片上的菌落数都小于15，则计数稀释度的测试片上的平均菌落数乘以稀释倍数报告之；如果所有稀释度的测试片上均无菌落生长，则以小于1乘以稀释倍数报告之。

④如果所有稀释度的菌落数都大于150，计数稀释度的测试片上的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。计数菌落数大于150的测试片时，也可计数一个或两个具有代表性的方格内的菌落数，换算成单个方格内的菌落数后乘以20（滤纸区面积为20c m2），即为测试片上估算的菌落数。报告单位以CFU/mL（或CFU/g）表示。

6.注意事项

样品勻液的pH值应在6.5～7.5之间，必要时用1 mol/L氢氧化钠（NaOH）或1 mol/L盐酸（HC1）调节pH。

7.保存条件

本产品需存放在4～10℃冰箱中，保质期为一年，铝箔袋打开后，未用完的纸片要放回铝箔袋中封好，放到冰箱中，一个月内用完。在高湿度的环境中可能出现冷凝水，在拆封前将整包回温至室温。