非洲猪瘟疫病毒快速检测取得突破

案例导入

案例：2019年2月15日，三全食品生产的水饺被曝检出非洲猪瘟疫病毒，引发了全社会的高度关注。2月18日下午，深交所对三全食品下发关注函，要求三全食品说明。随后三全食品回应称，公司已第一时间将相关疑似批次产品从各销售渠道全部封存，并拟销毁。

那么什么是非洲猪癌疫病毒？非洲猪瘟疫病毒有什么危害？如何采用快速检测方法检测非洲猪瘟疫病毒呢？

非洲猪癌病毒（ASFV）是非洲猪瘟科非洲猪瘟病毒属的重要成员，病毒有些特性类似虹彩病毒科和痘病毒科。病毒粒子的直径为175～215 nm，呈20面体对称，有囊膜。基因组为双股线状DNA，大小170～190 kb。在猪体内，非洲猪瘟病毒可在几种类型的细胞浆中，尤其是网状内皮细胞和单核巨噬细胞中复制。该病毒可在钝缘蜱中增殖，并使其成为主要的传播媒介。非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的家猪、野猪的一种急性、热性、高度接触性动物传染病，所有品种和年龄的猪均可感染，发病率和死亡率最高可达100%，临床表现为发热（达40～42℃），心跳加快，呼吸困难，部分咳嗽，眼、鼻有浆液性或黏液性脓性分泌物，皮肤发绀，淋巴结、肾、胃肠黏膜明显出血。目前全世界没有有效的疫苗。该病毒具有耐酸不耐碱、耐冷不耐热的特点，低温暗室内存在血液中的病毒可生存六年，室温中可活数周，加热被病毒感染的血液55℃30 min或60℃10 min，病毒将被破坏，许多脂溶剂和消毒剂可以将其破坏。健康猪与患病猪或污染物直接接触是非洲猪瘟最主要的传播途径，猪被带毒的蜱等媒介昆虫叮咬也可传播。世界动物卫生组织将其列为法定报告动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。

非洲猪瘟不是人畜共患病，病毒不感染人，对人体健康和食品安全不产生直接影响。但非洲猪瘟病毒传染性强，危害特别大，一旦感染上，整个猪场甚至所在的地区的生猪都要被扑杀，给养殖户造成的损失是无可估量的。下面介绍下非洲猪瘟疫病毒的快速检测法。

一、等温扩增快速检测法

1.范围

本标准规定了非洲猪癌病毒等温扩增快速检测方法的技术要求。

本标准适用于非洲猪癌疫病的诊断、监测及流行病学调查，适用于猪血液、脾脏、淋巴结、肾脏等组织样品中非洲猪瘟病毒核酸的快速检测。

2.规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB 19489《实验室生物安全通用要求》。

3.原理

非洲猪瘟病毒是一种DNA病毒，该检测方法利用6条特异性引物和具有链置换能力的DNA聚合酶，在等温环境下1 h内完成扩增，用于非洲猪瘟病毒的核酸检测。

4.仪器及器材

高速台式冷冻离心机（离心范围0～20000 r/min）、冰箱（4±1）℃、（-20±1）℃、（-7±1）℃、恒温LAMP扩增仪（型号：Gene-8C）、离心管（15 mL离心管、1.5 mL离心管和0.2 mL PCR专用离心管）、微量移液器（1000 μL、200 μL、100 μL、50 μL、20 μL、10 μL、2 μL）

5.试剂及引物

样品处理剂、ASFV-R-Mix、Bst酶、D-I矿物油、阳性对照、阴性对照。

注：本技术规范中使用的试剂，除另有说明外，所有实验使用的试剂等级均为不含DNA或DNase的分析纯或生化试剂；所有试剂均用无菌的容器分装。具体见附录A。

6.操作步骤

（1）样品的采集、前处理、存放与运输

①采样注意事项。

采集样品及样品前处理过程中应戴一次性手套，样本间不得交叉污染。

②采样工具。

15 mL离心管和1.5 mL离心管经（121±1）℃高压灭菌20 min；剪刀、慑子经160：干热灭菌2 h，无菌管（真空采血管）。

③组织病料的采集与前处理采集疑似非洲猪瘟病毒感染猪的肺脏、肝脏、肾脏、脾脏等组织样品，用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品约10 g于组织勻浆器或研钵中充分勻浆或研磨，加入0.3～0.5 mL组织悬液混勻，60℃，30 min灭活后，将悬液转入无菌Eppendof管中，4℃条件下5000 r/min离心10 min，编号备用。

④全血及血清样本的采集与前处理。

使用含有抗凝血剂（EDTA-紫色盖）的无菌管（真空采血管）从耳静脉或前腔静脉采集血液3～5 mL，60℃，30 min灭活后，可直接检测；若检测血清，可静置全血样本待血清析出后，直接吸取至无菌Eppendof管中，60℃，30 min灭活后，编号备用。

⑤存放与运输采集或处理的样品。

在2～8℃条件下保存应不超过24 h；若需长期保存，应放置-70℃冰箱，但应避免反复冻融（冻融不超过3次）。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，在8 h之内运送到实验室检测。按照《兽医实验室生物安全技术管理规范》进行样品的生物安全标识。

（2）样品DNA的提取

取10 μL前处理过的样本加入无菌1.5 mL离心管，加入10 μL样品处理剂，混勻，94℃裂解2 min，瞬时离心，上清即为扩增模板。

（3）核酸扩增

①吸取22 μL ASFV-R-Mix和1 μL Bst酶加入同一个PCR管，吸取2 μL步骤（2）处理的核酸扩增模板加至PCR管，混勻，设置阴阳性对照。

②吸取10 μL D-I矿物油轻轻加至PCR管液面，切勿震荡混勻。

③插入到恒温扩增仪反应槽中。

④设置恒温扩增仪器反应条件为：65℃反应12 min，荧光采集周期20s。

7.试验成立条件与结果判定

（1）试验成立条件

使用前用阴、阳性对照进行该检测方法评价，若阳性对照CT值≤40，阴性对照CT值＞40，则检测结果有效。

（2）结果判定

若CT值≤40，样品应判定为非洲猪瘟病毒核酸阳性；若CT值＞40，样品应判定为非洲猪瘟病毒核酸阴性。

8.实验室生物安全要求

按照GB 19489《实验室生物安全通用要求》执行。

二、胶体金测试卡法

1.范围

用于快速检测全血或病料组织（脾脏）中的非洲猪瘟抗原（ASF）。

2.原理

采用双抗体夹心法检测样品中的非洲猪瘟抗原。当样品中存在非洲猪瘟抗原时，会在免疫层析试纸条的T线位置形成红色条带。C线作为内控使用，C线出现说明实验有效，否则应重新实验。

3.试剂及材料

胶体金测试试剂盒：内含非洲猪瘟快检卡、样品处理管（内含样品处理液）、一次性滴管和说明书。

4.检测步骤

（1）全血样本的检测

①待测样品准备：用一次性吸管吸取新鲜全血样品，滴3～4滴至样品处理管中。用吸管反复吹打8～10次，使细胞全部裂解。

注：A.全血样品应为新鲜采集或2～8℃保存不超过72h的EDTA抗凝血。

B.样品处理管中含有样品处理液，由于运输颠簸等原因，液体可能粘在管帽或管壁上。在开盖前，用力甩下或用离心机快速离心30s使得液体进入处理管底部。

C.用吸管反复吸起并吹出液体8～10次使得细胞全部裂解，病毒释放出来。此步骤直接影响检测结果。

②快检卡复温：快检卡如保存在低温环境下，需在室温条件下复温（20～25℃）半小时。

③反应：打开铝箔袋取出快检卡，吸取步骤①中处理后的样品3～4滴，逐滴滴入快检卡的加样孔中，水平静止。

④观察结果：15～20 min后观察结果，不可超过30 min。

（2）脾脏组织检测

①采样：采集玉米粒大小的病料组织（比如脾），置于样品处理管中。

②提取：用研磨棒反复研磨使成浆糊状，用离心机离心或静止使其自然沉降。

③快检卡回温：快检卡如保存在低温环境下，需在室温条件下复温（20～25℃）半小时。

④反应：打开铝箔袋取出快检卡，吸取步骤②中的提取液上清3～4滴，逐滴滴入快检卡的加样孔中，水平静止。

⑤观察结果：15～20 min后观察结果，不可超过30 min。

5.结果判定

结果判定图如图5-4所示。

①阳性（+）：两条紫红色条带出现。一条位于质控区（C）内，另一条位于测试区（T）内。阳性结果表明：样本中含有非洲猪癌抗原。

注：A.测试区（T）出现的线条强弱会因为样本中非洲猪瘟抗原的浓度而有所变化。因此，任何紫红色印记的T线出现，即可判为阳性。

B.通常情况下，脾脏组织病毒含量高于全血；常规方法制备的血清或血浆低于全血（淋巴细胞未裂解，病毒释放较少）。

②阴性（-）：仅质控区（C）出现一条紫色条带，在测试区（T）内无紫色条带出现。阴性结果表明：样本中不含非洲猪瘟抗原，或者含量低于本产品的检测水平。

③无效：质控区（C）未出现紫色条带，表明不正确的操作过程或试剂已变质损坏。在此情况下，应用新的快检卡重新测试。

图5-4　结果判定图

附录A

（规范性附录）(www.xing528.com)

试剂配制

1.样品处理剂的制备

量取80 mL PBS（0.01 mol/L,pH值7.4），加入10 μLNP40（乙基苯基聚乙二醇），无菌纯化水定容至100 mL，定量分装，500 μL/管，-20℃保存。

2.ASFV-R-Mix的制备

（1）引物合成

根据非洲猪瘟病毒P72基因片段的保守结构域设计3对引物，包括1对内引物（FIP与BIP）、1对外引物（F3与B3）和1对环引物（LF与LB），均由上海生工生物工程股份有限公司合成，序列为：

FIP：5'-TAACGCCACTATGCAGCCCACGGAAGAGCTGAATCTCTATCCT-3'

BIP：5'-CAACATGTGCGAACTTGTGCCACATACCTGGAACGTCTCC-3'

F3：5'-ATAGGTAATGCGATCGGATACA-3'

B3：5'-CCAACAATAACCGCCACGC-3'

LF：5'-TCGCCACGCAAAGATAAGC-3'

LB：5'-AGCCTCGGTGTTGATGCGGATT-3'

（2）引物混合物的制备

取3对引物（FIP、BIP、F3、B3、LF和LB）干粉，按引物说明书分别加入适量无菌纯化水，溶解混勻，得到各引物溶液，置-20℃保存。

（3）ASFV-R-Mix的配制

称取2.4 gTris，0.37 g氯化钾，0.12 g硫酸镁，100 μL吐温20，7.029 g甜菜碱，溶于80 mL纯化水，依次加入终浓度为1.4 mmol/L dNTPs溶液、0.2μmol/L外引物溶液、1.6μmol/L内引物溶液、0.8μmol/L环引物溶液，加入无菌纯化水定容至100 mL，经过0.22μm滤器过滤除菌，分装至2 mL蓝盖可立冻存管中，1.1 mL/管，-20℃保存。

3.Bst酶的制备

用于制备本试剂盒的Bst酶为商品化DNA聚合酶，按使用说明书用纯化水稀释至4×106/L，分装至0.5 mL白盖可立冻存管中，100 μL/管，-20℃保存。

4.D-I矿物油

用于制备本试剂盒的D-I矿物油为商品化矿物油，分装至2 mL黄盖可立冻存管中，500 μL/管，-20℃保存。

5.阳性对照

采用核酸蛋白质分析仪测定阳性质控品浓度，计算质粒拷贝数，用纯化水将其稀释为103拷贝/μL，分装至0.5 mL红盖可立冻存管中，100 μL/管，-20℃保存。

6.阴性对照

取纯化水，分装至0.5 mL绿盖可立冻存管中，100 μL/管，-20℃保存。

附录B

快速检测方法性能指标计算如表5-6。

表5-6　快速检测方法性能指标计算

目标检测

一、单选题

1.实时荧光PCR法测定肉类掺假时，若样本检测通道Ct值低于参考值，且有S型扩增曲线，则报告该源性成分检测（）。

A.阴性

B.阳性

2.环介导恒温荧光扩增法测定肉类掺假时，若样本（）S型扩增曲线，则报告该源性成分检测阳性。

A.有

B.没有

3.重组酶介导恒温荧光扩增法测定肉类掺假时，若样本有典型扩增曲线，且出峰时间或Ct值（）参考值，则报告该源性成分检测阳性。

A.低于

B.高于

4.肉中挥发性盐基氮含量越（），表明氨基酸被破坏的越多。

A.高

B.低

5.胶体金免疫层析法测定肉中喹诺酮类药物残留的原理是（）免疫层析。

A.竞争性

B.非竞争性

6.胶体金免疫层析法测定肉中喹诺酮类药物残留时，检测线（T线）不显色或检测线（T线）颜色比质控线（C线）颜色浅，表明样品中喹诺酮类的含量高于方法检测限，判定为（）。

A.阴性

B.阳性

7.比色法快速检测肉中亚硝酸盐时，样品中的亚硝酸盐经提取后，在弱酸性条件下与对氨基苯磺酸重氮化后，再与（）反应生成紫红色偶氮化合物，其颜色的深浅在一定范围内与亚硝酸盐含量成正相关，通过色阶卡进行目视比色，对样品中亚硝酸盐进行定性判定。

A.盐酸萘乙二胺

B.丙酮

8.非洲猪瘟（）人畜共患病。

A.是

B.不是

9.非洲猪瘟病毒是一种（）病毒。

A.DNA

B.RNA

10.等温扩增快速检测法测定非洲猪瘟疫病毒时，若CT值≤40，样品应判定为非洲猪瘟病毒核酸（）。

A.阴性

B.阳性

二、多选题

1.下列哪些药物属于动物常用抗菌药（）。

A.沙拉沙星

B.恩诺沙星

C.奥比沙星

D.达诺沙星

2.下面属于瘦肉精类药物的是（）。

A.克伦特罗

B.莱克多巴胺

C.沙丁胺醇

D.磺胺嘧啶

答案及解析

一、单选题

1.B 2.A 3.A 4.A 5.A 6.B 7.A 8.B 9.A 10.B

二、多选题

1.ABCD 2.ABC