肉制品中亚硝酸盐快速检测技术

案例导入

案例：2015年8月29日，冯某某等6人食用涂某所制作的卤肉后，当天便陆续出现腹痛、恶心、口唇发绀等不适症状，被阆中市人民医院诊断为亚硝酸盐中毒。后经阆中疾病预防控制中心检测，在涂某所销售的卤肉制品及冯某某的呕吐物中，检测出亚硝酸钠残留量严重超出《食品安全国家标准　食品添加剂使用标准》。涂某因生产、销售不符合安全标准的食品，被判处有期徒刑十个月，缓刑一年。同时，法院判决涂某在缓刑期内，禁止从事有关食品销售工作。

那么什么是亚硝酸盐？亚硝酸盐究竟有什么危害？如何采用快速检测方法检测肉制品中的亚硝酸盐呢？

亚硝酸盐是自然界中普遍存在的一类含氮无机化合物的总称，主要包括亚硝酸钠和亚硝酸钾，其外观与食盐类似，呈白色至淡黄色，粉末或颗粒状，无臭，味微咸，易潮解和溶于水。亚硝酸盐可作为食品添加剂限量应用到肉制品中。在香肠、腊肉等肉制品加工中常通过添加限量的亚硝酸盐起到护色和防腐的效果。亚硝酸盐可与肉品中的肌红蛋白反应生成玫瑰色亚硝基肌红蛋白，增进肉的色泽，起到护色效果；亚硝酸盐还可防止肉毒梭菌的生长，延长肉制品的货架期，从而起到防腐剂的作用。

亚硝酸盐是剧毒物质，GB 2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》规定，肉制品中亚硝酸盐的使用限量为≤0.15 g/kg。成人摄入0.3～0.5 g的亚硝酸盐即可引起中毒，3 g即可导致死亡。亚硝酸盐中毒发病急速，一般潜伏期1～3h，中毒的主要特点是由于组织缺氧引起的紫绀现象，如口唇、舌尖、指尖青紫，重者眼结膜、面部及全身皮肤青紫，并伴有头晕、头疼、乏力、心跳加速、嗜睡、烦躁、呼吸困难、恶心、呕吐、腹痛、腹泻，严重者可出现昏迷、惊厥、大小便失禁，直至呼吸衰竭而死亡。亚硝酸盐还能与食品中、人体内的仲胺类化合物反应生成具有强致癌性的亚硝胺类化合物。下面介绍肉制品中亚硝酸盐的快速检测方法。

1.范围

本方法规定了食品中亚硝酸盐的快速检测方法。

本方法适用于肉及肉制品（餐饮食品）中亚硝酸盐的快速测定。

2.原理

样品中的亚硝酸盐经提取后，在弱酸性条件下与对氨基苯磺酸重氮化后，再与盐酸萘乙二胺反应生成紫红色偶氮化合物，其颜色的深浅在一定范围内与亚硝酸盐含量呈正相关，通过色阶卡进行目视比色，对样品中亚硝酸盐进行定性判定。

3.试剂及材料

（1）试剂

除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682-2016规定的二级水。

①盐酸（20%）：量取20 mL盐酸，用水稀释至100 mL。

②对氨基苯磺酸溶液（4 g/L）：称取0.4 g对氨基苯磺酸，溶于100 mL 20%盐酸中，混勻，置棕色瓶中，临用新制。

③盐酸萘乙二胺溶液（2 g/L）：称取0.2 g盐酸萘乙二胺，溶解于100 mL水中，混勻，置棕色瓶中，临用新制。

（2）参考物质

亚硝酸钠参考物质中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、分子量见表5-5，纯度≥99%。

表5-5　亚硝酸钠中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、分子量

（3）标准溶液配制

亚硝酸钠标准工作液（200 μg/mL，以亚硝酸钠计）：精密称取适量经110～120℃干燥恒重的亚硝酸钠参考物质，加水溶解，移入250 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混勻。

（4）材料

亚硝酸盐快速检测试剂盒：适用基质为肉及肉制品，需在阴凉、干燥、避光条件下保存。

4.仪器及设备

移液器（200 μL、l mL）、涡旋混合器或超声仪、电子天平或手持式天平（感量为0.01 g和0.0001 g）、离心机、微孔滤膜（0.45μm水系）。

5.分析步骤

（1）试样制备

取适量有代表性样品的可食部分，充分粉碎混勻。

（2）试样的提取

准确称取试样1 g（精确至0.01 g），置于离心管中，准确加水10 mL，超声或涡旋振荡提取5 min，静置10 min。准确吸取1 mL上清液（如样品浑池，≥3000 r/min离心5 min取上清液，或经微孔滤膜过滤后取续滤液）于检测管中，向检测管中滴加对氨基苯磺酸溶液200 μL，混勻静置1 min，再加入盐酸萘乙二胺溶液100 μL，混勻静置5 min，即得待测液。

（3）测定步骤(www.xing528.com)

将待测液与标准色阶卡目视比色，10 min内判读结果。进行平行试验，两次测定结果应一致，即显色结果无肉眼可辨识差异。

（4）质控试验

每批样品应同时进行空白试验和质控样品试验（或加标质控试验）。用色阶卡和质控试验同时对检测结果进行控制。

①空白试验。

称取空白样品，按照（2）和（3）步骤与样品同法操作。

②质控样品试验（或加标质控试验）。

亚硝酸盐质控样品：采用典型样品基质或相似样品基质按照实际生产工艺生产的，含有一定量亚硝酸盐并可稳定保存的样品。经参比方法确认的质控样品中亚硝酸盐含量（以亚硝酸钠计）应包括但不限于10 mg/kg。

加标质控样品：准确称取空白试样1 g（精确至0.01 g），置于离心管中，加入适量亚硝酸钠标准工作液（200 μg/mL）使样品中亚硝酸钠含量为10 mg/kg。

质控样品（或加标质控样品）按（2）和（3）步骤与样品同法操作。

6.结果判定

观察检测管中样液颜色，与标准色阶卡比较判读样品中亚硝酸盐（以亚硝酸钠计）的含量。颜色浅于检出限（1 mg/kg）则为阴性样品；颜色深于10mg/kg则为阳性样品。色阶卡见图5-3。

注：A.颜色接近或深于1 mg/kg，但浅于或接近10 mg/kg时，则考虑本底污染。

B.10 mg/kg仅作为本方法的本底控制限。

图5-3　亚硝酸盐色阶卡

质控试验要求：空白试验测定结果应为阴性，质控样品试验测定结果应在其标示量值允差范围内，加标质控试验测定结果应与加标量相符。

7.结论

由于色阶卡目视判读存在一定误差，为尽量避免出现假阴性结果，读数时遵循就高不就低的原则。当测定结果大于10 mg/kg时，应对结果进行确证。

8.性能指标

①检出限：1 mg/kg。

②灵敏度：灵敏度应≥99%。

③特异性：特异性应≥85%。

④假阴性：假阴性应≤1%。

⑤假阳性：假阳性应≤15%。

注：性能指标计算方法见附录B。

9.其他

本方法所述试剂、试剂盒信息及操作步骤是为方法使用者提供方便，在使用本方法时不作限定。方法使用者在使用替代试剂、试剂盒或操作前，须对其进行考察，应满足本方法规定的各项性能指标。

本方法参比方法为GB 5009.33-2016《食品安全国家标准食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》。

待测样品中若存在高含量的亚硫酸氢钠、抗坏血酸或酱油时，会对本法的显色结果产生一定影响，检测时应予以注意。

色阶卡应确保在试剂盒保质期内不出现褪色或变色的情况。