肉类食品快速检测技术

案例导入

案例：2011年3月15日央视新闻频道《每周质量报告》的3·15特别节目播出了《“健美猪”真相》，对于河南孟州等地部分养猪场饲喂有“痩肉精”的生猪流入济源双汇食品有限公司进行了报道。济源双汇分公司瞬间成为众矢之的，双汇集团也一度被推到舆论的风口浪尖。

那么什么是痩肉精？痩肉精和克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇有什么关系？究竟有什么危害？如何采用快速检测方法检测呢？

痩肉精是一类肾上腺受体激动剂，肾上腺素受体激动剂（简称兴奋剂）是具有苯乙醇胺结构的一类物质，可分为含取代基的苯胺型（如盐酸克伦特罗）、苯酚型（如沙丁胺醇）、苯二酚型（如特布他林）三大类，主要包括盐酸克伦特罗、莱克多巴胺以及沙丁胺醇、溴布特罗、溴氯布特罗、马布特罗等。β-受体激动剂早期主要用于防治人、动物支气管哮喘和支气管痉挛，后来研究发现在饲料中添加这类药物具有营养再分配作用，可以起到促进动物生长、改善动物胴体结构、提高瘦肉率的作用，因此，该药物曾被作为一种药物促生长添加剂被广泛用于动物生产。但是人们食用了残留有这些药物的畜肉产品后会出现面色潮红、头痛、头晕、胸闷、心悸、四肢麻木等不良反应症状，严重的可能危及生命。因此，欧盟、美国等都先后立法禁止在畜禽生产上使用该类药物，我国农业部公告第235号（2002）规定严禁在畜牧生产上使用各种兴奋剂类药物。下面介绍肉类等动物源性食品中克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇的快速检测胶体金免疫层析法。

1.范围

本方法规定了动物肌肉组织中克伦特罗、莱克多巴胺及沙丁胺醇的胶体金免疫层析快速检测方法。

本方法适用于猪肉、牛肉等动物肌肉组织中克伦特罗、莱克多巴胺及沙丁胺醇的快速测定。

2.原理

本方法采用竞争抑制免疫层析原理。样品中克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制抗体和检测卡中检测线（T线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。通过检测线与质控线（C线）颜色深浅比较，对样品中克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇进行定性判定。

3.试剂及材料

除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682-2016规定的二级水。

（1）试剂

甲醇（色谱纯）、氢氧化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、盐酸、氯化钠、氯化钾、三氮化钠、乙二胺四乙酸二钠、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、乙酸乙酯、磷酸二氢钠。

①氢氧化钠溶液（1 mol/L）：称取氢氧化钠4 g，用水溶解并稀释至100 mL。

②缓冲液：准确称取磷酸二氢钾0.3 g磷酸氢二钠1.5 g溶于约800 mL水中，充分混勻后用盐酸或氢氧化钠溶液调节pH至7.4，用水稀释至1000 mL，混勻。4℃保存，有效期三个月。

③展开液：准确称取磷酸二氢钾2 g，磷酸氢二钠1.44 g，氯化钠8 g，氯化钾0.2 g，三氮化钠0.5 g，乙二胺四乙酸二钠1.0 g溶于约500 mL水中，充分混勻后用水稀释至1000 mL。

④Tris缓冲液（pH 9.0，1 mol/L）：称取Tris 12114 g，溶于约700 mL水中，充分混匀后加入盐酸调试pH至9.0后用水定容至1000 mL。

⑤Tris缓冲液（pH 9.0，10 mmo/L）：精密量取1 mo/L Tris缓冲液1 mL，用水稀释定容至100 mL。

⑥磷酸二氢钠溶液（0.2 mol/L）：称取磷酸二氢钠24.0 g，用水溶解并稀释至1000 mL。

⑦磷酸氢二钠溶液（0.2 mol/L）：称取磷酸氢二钠28.4 g，用水溶解并稀释至1000 mL。

⑧磷酸盐缓冲液（pH 7.4，0.2 mol/L）：量取磷酸二氢钠溶液19 mL，加入81 mL磷酸氢二钠溶液，混勻。

⑨磷酸盐缓冲液（pH 7.4，10 mmol/L）：精密量取0.2 mol/L磷酸盐缓冲液50 mL，用水稀释至1000 mL。

（2）参考物质

克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、分子量见表5-4，纯度≥97%。

表5-4　克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、分子量

（3）标准溶液配制

①标准储备液：精密称取适量克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇参考物质，分别置于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇勻，分别制成浓度为100 μg/mL的克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇标准储备液。-18℃保存，有效期一年。

②克伦特罗标准中间液（1 μg/mL）：精密量取克伦特罗标准储备液（100 μg/mL）1 mL置于100 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇勻，制成浓度为1 μg/mL的克伦特罗标准中间液。临用新制。

③克伦特罗标准工作液（20 ng/mL）：精密量取克伦特罗标准中间液（1 μg/mL）1 mL，置于50 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇勻，制成浓度为20 ng/mL的克伦特罗标准工作液。临用新制。

④莱克多巴胺标准中间液（1 μg/mL）：精密量取莱克多巴胺标准储备液（100 μg/mL）1 mL置于100 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇勻，制成浓度为1 μg/mL的莱克多巴胺标准中间液。临用新制。

⑤莱克多巴胺标准工作液（20 ng/mL）：精密量取莱克多巴胺标准中间液（1 μg/mL）1 mL，置于50 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇勻，制成浓度为20n g/mL的莱克多巴胺标准工作液。临用新制。

⑥沙丁胺醇胺标准中间液（1 μg/mL）：精密量取沙丁胺醇标准储备液（100 μg/mL）1 mL置于100 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇勻，制成浓度为1 μg/mL的沙丁胺醇标准中间液。临用新制。

⑦沙丁胺醇标准工作液（20 ng/mL）：精密量取沙丁胺醇标准中间液（1 μg/mL）1 mL，置于50 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇勻，制成浓度为20 ng/mL的沙丁胺醇标准工作液。临用新制。

（4）材料

①克伦特罗试剂盒/检测卡（条）：含胶体金试纸条及配套的试剂。

②莱克多巴胺试剂盒/检测卡（条）：含胶体金试纸条及配套的试剂。

③沙丁胺醇试剂盒/检测卡（条）：含胶体金试纸条及配套的试剂。

④固相萃取柱：丙烯酸系弱酸性阳离子交换柱。

4.仪器及设备

电子天平（感量为0.01 g和0.0001 g）、组织粉碎机、水浴箱、离心机（转速≥4000 r/min）、移液器（10 μL、100 μL、1 mL、5 mL）、读数仪（产品配套可使用的检测仪器（可选））、固相萃取装置（可选）、其他产品说明书操作中需用的仪器、环境条件（温度10～40℃，湿度≤80%）。

5.分析步骤

（1）试样制备

取适量具有代表性样品的可食部分，充分粉碎混勻。

（2）试样提取和净化

称取适量试样，按照方法一或方法二提取步骤分别对空白试样、加标质控样品、待测样进行处理。

①方法一（隔水煮法）。

称取粉碎混勻的样品5 g（精确至0.01 g）于50 mL离心管，置90℃水浴中加热20 min至离心管中可清晰看见有组织液渗透，4000r/min离心10 min，将上清液转至另一离心管，重复离心操作一次。准确量取上清液900 μL，加入缓冲液100 μL混勻，即得待测液。本方法推荐水浴加热，也可按照试剂盒说明书进行操作。

②方法（固相萃取法）。

称取粉碎混勻的样品5 g（精确至0.01 g）于50 mL离心管，加入10 mmol/Tris缓冲液5 mL，剧烈振摇5 min，放置20 min，加入乙酸乙醋10 mL，剧烈振摇1 min。以4000 r/min离心2 min，上清液待净化。连接好固相萃取装置，并在固相萃取柱上方连接30 mL注射器针筒，将上述上清液全部倒入30 mL针筒中，用手缓慢推压注射器活塞，控制液体流速约1滴/秒，使注射器中液体全部流过固相萃取柱，尽可能将固相萃取柱中溶液去除干净。将固相萃取柱下方的接液管更换为洁净的离心管，向固相萃取柱中加入0.5 mL 10 mmol/L磷酸盐缓冲液。用手缓慢推压注射器活塞，控制液体流速约1滴/秒，使固相萃取柱中的液体全部流至离心管中，即得待测液。

注：试样制备过程可按照试剂盒说明书进行操作，不做限定。

（3）测定步骤(www.xing528.com)

①检测卡与金标微孔测定步骤。

测试前，将未开封的检测卡恢复至室温。吸取100 μL上述待测液于金标微孔中，上下抽吸5～10次直至微孔试剂混合均勻。室温温育5 min，将反应液全部加入到检测卡的加样孔中，1 min后加入1滴展开液。检测卡加入样本后10 min进行结果判定。

②无金标微孔时，检测卡测定步骤。

测试前，将未开封的检测卡恢复至室温。吸取100 μL上述待测液直接加入到检测卡加样孔中，1 min后加入1滴展开液。检测卡加入样本后10 min后进行结果判定。

③试纸条与金标微孔测定步骤。

测试前，将未开封的试纸条恢复至室温。吸取100 μL上述待测液于金标微孔中，上下抽吸5～10次直至微孔试剂混合均勻。室温温育1 min，将试纸条样品垫插入到金标微孔中。室温温育4 min，从微孔中取出试纸条，去掉试纸条下端样品垫，进行结果判定。

注：A.测定步骤建议按照试剂盒说明书进行操作。

B.结果判定建议使用读数仪，读数仪的具体使用参照仪器使用说明书。

（4）质控试验

每批样品应同时进行空白试验和加标质控试验。

①空白试验。

称取空白试样，按照（2）和（3）步骤与样品同法操作。

②加标质控试验。

称取空白试样5 g（精确至0.01 g）置于50 mL离心管中，加入适量克伦特罗标准工作液（20 ng/mL），使克伦特罗浓度为0.5 μg/kg，按照（2）和（3）步骤与样品同法操作。

称取空白试样5 g（精确至0.01 g）置于50 mL离心管中，加入适量莱克多巴胺标准工作液（20 ng/mL），使莱克多巴胺浓度为0.5 μg/kg，按照（2）和（3）步骤与样品同法操作。

准确称取空白试样5 g（精确至0.01 g）置于50 mL离心管中，加入适量沙丁胺醇标准工作液（20 ng/mL），使沙丁胺醇浓度为0.5 μg/kg，按照（2）和（3）步骤与样品同法操作。

6.结果判定

（1）读数仪测定结果

通过仪器对结果进行判读。

①无效。

当质控线（C线）不显色时，无论检测线（T线）是否显色，均表示实验结果无效。

②阳性结果。

若检测结果显示“+”（阳性），表示试样中含有待测组分且其含量大于等于方法检测限。

③阴性结果。

若检测结果显示“-”（阴性），表示试样中不含待测组分或其含量低于方法检测限。

（2）目视判定

通过对比质控线（C线）和检测线（T线）的颜色深浅进行结果判定。目视判定示意图见图5-2。

图5-2　目视判定示意图

①无效。

当质控线（C线）不显色时，无论检测线（T线）是否显色，均表示实验结果无效。

②阳性结果。

质控线（C线）显色，若检测线（T线）不出现或出现但颜色浅于质控线（C线），表示试样中含有待测组分且其含量高于方法检测限，判为阳性。

③阴性结果。

质控线（C线）显色，若检测线（T线）颜色深于或等于质控线（C线），表示试样中不含待测组分或其量低于方法检测限，判为阴性。

（3）质控试验要求

空白试样测定结果应为阴性，加标质控样品测定结果应为阳性。

7.结论

当检测结果为阳性时，应对结果进行确证。

8.性能指标

①检测限：克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇检出限均为0.5 μg/kg。

②灵敏度：灵敏度应≥95%。

③特异性：特异性应≥85%。

④假阴性率：假阴性率≤5%。

⑤假阳性率：假阳性率应≤15%。

注：性能指标计算方法见附录B。

9.其他

本方法所述试剂、试剂盒信息、操作步骤及结果判定要求是为方法使用者提供方便，在使用本方法时不做限定。方法使用者在使用替代试剂、试剂盒或操作步骤前，须对其进行考察，应满足本方法规定的各项性能指标。

本方法参比方法为GB/T 22286-2008《动物源性食品中多种β-受体激动剂残留量的测定液相色谱串联质谱法》（包括所有的修改单）。

本方法使用克伦特罗试剂盒可能与沙丁胺醇、特布他林、西马特罗等有交叉反应，当结果判定为阳性时，应对结果进行确证。

本方法使用沙丁胺醇试剂盒可能与克伦特罗、特布他林、西马特罗等有交叉反应，当结果判定为阳性时，应对结果进行确证。