食品中喹诺酮类药物残留快速检测技术

案例导入

案例：2016年2月24日，国家食品药品监督管理总局发布抽检通告，在抽检的374批次样品中有8个批次肉类及其制品不合格，原因是其中的磺胺类、土霉素、氟苯尼考、沙拉沙星、恩诺沙星兽用抗菌素残留超标。

那么什么是喹诺酮类药物？喹诺酮类药物究竟有什么危害？如何采用快速检测方法检测肉类等动物源性食品中的喹诺酮类药物呢？

喹诺酮类药物是人工合成的具有1，4-二氢-4-氧化喹啉-3-羧酸结构的一类药物的总称，分为四代，目前临床应用较多的为第三代，常用药物有诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星、氟罗沙星等。动物专用的有沙拉沙星、恩诺沙星、丹诺沙星、马波沙星、奥比沙星、达诺沙星。

喹诺酮类药物是畜禽类和人类的主要抗菌药物之一。主要通过阻断特异性拓扑酶、抑制细菌DNA复制从而发挥抗菌作用。该药具有价格低廉、抗菌谱广、无交叉耐药性等优点，广泛应用于动物和人类的感染性疾病的治疗和预防。但喹诺酮类药物常有不合理使用和滥用的情况发生，使其或其代谢产物残留于动物肌肉和脏器中，进而通过食物链导致人体产生抗药性，影响疾病的治疗与康复，引起严重的肉类等动物源性食品的安全问题。因此，肉类等动物源性食品中喹诺酮类药物残留问题越来越引起人们的重视。下面介绍肉类等动物源性食品中喹诺酮类药物残留快速检测胶体金免疫层析法。

1.范围

本方法规定了动物源性食品中喹诺酮类物质的胶体金免疫层析快速检测方法。

本方法适用于生乳、巴氏杀菌乳、灭菌乳、猪肉、猪肝、猪肾中洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、达氟沙星、二氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、氟甲喹、噁喹酸残留的快速测定。

2.原理

本方法采用竞争抑制免疫层析原理。样品中的喹诺酮类物质与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制了抗体和检测线（T线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色变化，通过检测线与质控线（C线）颜色深浅比较，对样品中喹诺酮类物质进行定性判定。

3.试剂及材料

除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682-2008规定的二级水。

（1）试剂

①乙腈。

②甲酸。

③分散固相萃取剂Ⅰ：分别称取硫酸镁18 g、醋酸钠4.5 g放于研钵中研碎。

④分散固相萃取剂Ⅱ：分别称取硫酸镁27 g、N-丙基乙二胺（PSA）4.5 g放于研钵中研碎。

⑤甲酸—乙腈溶液：98 mL乙腈中加人2 mL甲酸，混勻。

⑥甲醇。

⑦稀释液：脱脂奶粉：水（1：10）。

（2）参考物质

喹诺酮类参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、分子量见表5-3，纯度≥99%。

表5-3　喹诺酮类参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、分子量

（3）标准溶液的配制

①喹诺酮类物质标准储备液（1 mg/mL）：分别精密称取喹诺酮类参考物质适量，置于50 mL烧杯中，加入适量甲醇超声溶解后，用甲醇转入10 mL容量瓶中，定容至刻度，摇勻，配制成浓度为1 mg/mL的喹诺酮标准储备液。-20℃避光保存，有效期6个月。

②喹诺酮类物质标准中间液（1 μg/mL）：分别吸取喹诺酮类标准储备液（1mg/mL）100 μL于100 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇勻，配制成浓度为1 μg/mL的喹诺酮类标准中间液。

（4）材料

金标微孔（含胶体金标记的特异性抗体）、试剂条或检测卡。

4.仪器及设备

移液器（100 μL、200 μL和1 mL）、涡旋混合器、离心机（转速≥4000r/min）、电子天平（感量为0.01 g）、孵育器（可调节时间、温度，控温精度±1℃）、读数仪、氮吹仪、环境条件[温度15～35℃，湿度≤80%（采用孵育器与读数仪时可不要求环境温度）]。

5.分析步骤

（1）试样制备

液体乳直接用于测定，猪肉、猪肝、猪肾用组织捣碎机等搅碎后备用。

（2）试样的提取

①生乳、巴氏杀菌乳、灭菌乳。

分别吸取同等体积的液体乳样品与稀释液混合后为待测液。

②猪肉、猪肝、猪肾。

准确称取（2.5±0.01）g均质后的组织样品于15 mL离心管中，加入5 mL甲酸—乙腈溶液，祸旋混合1 min，振荡5 min，4000 r/min离心5 min。将上清液2 mL转入10 mL离心管中，分别加入0.6 g分散固相萃取剂I漩涡混合1 min，再加入0.6 g分散固相萃取剂Ⅱ后漩涡混合1 min，静置分层后取1 mL于10 mL离心管中，于氮吹仪60℃吹干后用1 mL样品稀释液溶解作为待测液。

（3）测定步骤

Ⅰ.检测卡测定步骤(www.xing528.com)

①将检测卡平放入孵育器中。小心撕开检测卡的薄膜至指示线处，避免提起检测卡和海绵。

②用移液器取待测液300 μL，避免产生泡沫和气泡。竖直缓慢地滴加至检测卡两侧任意一侧的凹槽中，将粘箔重新粘好。

③盖上孵育器的盖子，孵育器上的计时器自动开始计时，红灯闪烁，孵育3 min。

④取出检测卡，不要挤压样品槽，放于读数仪中，读数前保持样品槽一端朝下直到在读数仪上读取结果，或从孵育器上取出后直接目视法进行结果判定。

I.试剂条与金标微孔测定步骤

吸取300 μL待测液于金标微孔中，抽吸5～10次使混合均勻，将试剂条吸水海绵端垂直向下插入金标微孔中，孵育5～8 min，从微孔中取出试剂条，进行结果判定。

注：试剂条（或检测卡）具体检测步骤可参考相应的说明书操作。

（4）质控试验

每批样品应同时进行空白试验和加标质控试验。

①空白试验。

称取空白试样，按照（2）和（3）步骤与样品同法操作。

②加标质控试验。

准确称取空白试样（精确至0.01 g）置于具塞离心管中，加入一定体积的诺氟沙星标准中间液，使诺氟沙星终浓度为6 μg/kg，按照（2）和（3）步骤与样品同法操作。

6.结果判定

（1）读数仪测定法

按读数仪说明书要求操作直接读取并进行结果判定。

（2）目视法

通过对比质控线（C线）和检测线（T线）的颜色深浅进行结果判定。目视判定示意图见图5-1。

图5-1　目视判定示意图

①无效。

质控线（C线）不显色，表明不正确操作或试剂条/检测卡无效。

②阴性。

检测线（T线）颜色比质控线（C线）颜色深或者检测线（T线）颜色与质控线（C线）颜色相当，表明样品中喹诺酮类低于方法检测限，判定为阴性。

③阳性。

检测线（T线）不显色或检测线（T线）颜色比质控线（C线）颜色浅，表明样品中喹诺酮类的含量高于方法检测限，判定为阳性。

（3）质控试验要求

空白试验测定结果应为阴性，加标质控试验测定结果应为阳性。

7.结论

当检测结果为阳性时，应对结果进行确证。

8.性能指标

①检测限：生乳、巴氏杀菌乳、灭菌乳、猪肉、猪肝、猪肾中洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、达氟沙星、二氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、氟甲喹、噁喹酸为3 μg/kg。

②灵敏度：灵敏度应≥99%。

③特异性：特异性应≥95%。

④假阴性率：假阴性率应≤1%。

⑤假阳性率：假阳性率应≤5%。

注：性能指标计算方法见附录A。

9.其他

本方法所述试剂、试剂盒信息及操作步骤是为方法使用者提供方便，在使用本方法时不做限定。方法使用者在使用替代试剂、试剂盒或操作步骤前，须对其进行考察，应满足本方法规定的各项性能指标。

本方法参比标准为GB/T 21312-2007《动物源性食品中14种喹诺酮药物残留检测方法液相色谱一质谱/质谱法》。