肉类掺假快速检测技术实现

案例导入

案例1：2013年1月，瑞典、英国和法国部分牛肉制品中发现了马肉，德国也宣布发现疑似此类“挂牛头卖马肉”情况。此外，爱尔兰、荷兰、罗马尼亚等多个欧洲国家卷入丑闻中，引发消费者反感。

案例2：2013年12月17日，市民王先生向某报社反映，称他在泉城路沃尔玛超市买了1600袋五香驴肉和五香牛肉后，食用后感觉口感异样，送往山东省出入境检测检疫局进行检测，检测结果显示，送检肉品中未检测出驴肉等成分，却检测出了狐狸肉。

那么不法商家为什么要对肉类进行掺假？肉类掺假究竟有什么危害？如何采用快速检测方法检测肉类掺假呢？

近年来，随着经济社会的发展，人们的生活水平得到了大幅提高，饮食结构也在逐渐发生变化，动物性蛋白质在饮食中所占的比例呈现逐渐升高的趋势。这使得许多不法商贩以价格低廉的马肉、猪肉、鸡肉或其他动物肉类冒充价格高昂的牛肉、羊肉，赚取高额利润。比如上面案例中提到的欧盟多国的“马肉风波”和济南沃尔玛超市熟驴肉中掺杂狐狸肉等事件。这些欺诈行为不仅扰乱了市场秩序，同时涉及了宗教饮食禁忌等问题，严重损害了消费者的利益，同时也带来了诸多食品安全隐患。下面介绍肉类掺假快速检测操作规程。

本规程规定了肉及肉制品中动物源性成分（猪、牛、羊、鸡、鸭等）的快速检测方法。

本规程适用于肉及肉制品中动物源性成分（猪、牛、羊、鸡、鸭等）的掺假鉴别快速检测。

第一法检测限为0.01%；第二法检出限为0.50%；第三法检出限为1.00%。

一、实时荧光PCR法

1.原理

采用PCR方法结合荧光探针检测技术，以目标动物的特异性基因片段为靶区域，设计特异性引物及荧光探针，通过实时监测PCR扩增产物的累积过程中荧光信号的变化对动物核酸进行快速检测，从而判定目标源性成分的有无。

2.仪器及设备

荧光定量PCR仪、移液枪（2.5 μL、10 μL、100 μL、1000 μL）、离心机、涡旋混勻器、天平（感量0.01 g）。

3.试剂及材料

①商品化动物源性成分检测试剂盒（PCR-荧光探针法）。

反应液Ⅰ（酶、dNTP、离子缓冲液等）、反应液Ⅱ（引物、探针等）、样本处理液（核酸提取裂解液）。

②灭菌离心管（1.5 mL或2.0 mL）。

③灭菌PCR反应管（200 μL、100 μL）。

④配套灭菌吸头。

⑤冰盒。

4.检测步骤

（1）试样制备

取待检样品200 g（根据实际情况可调整），采用均质器、剪刀等实验器具对样本进行均质处理；称取上述均质样品50mg左右置于1.5 mL离心管内，加入样本处理液，振荡混匀5 s，备用。

注：加工后的食品样本可能含有盐、糖、植物色素和发酵产生的有色物质，会影响下游实验操作，应在均质样品前通过双蒸水洗涤方式尽量去除样品中的盐、糖和色素等干扰物质。

（2）扩增试剂准备

从试剂盒中取出反应液Ⅰ、反应液Ⅱ、阳性对照品、阴性对照品，待其充分溶解后，振荡混勻5s，瞬时离心。

根据所要检测的样本数n和各1份阳性对照品与阴性对照品，取（n+2）份的反应液Ⅰ、反应液Ⅱ，充分混合后，分装于PCR反应管中备用，分装时应尽量避免气泡。

（3）加样

在分装有反应液的PCR反应管中分别加入待检样本DNA、阳性对照品、阴性对照品，压紧管盖，混勻后瞬时离心。

注1：加样时应使样本完全落入反应液中，不应黏附于管壁上，加样后应尽快压紧管盖。

注2：试剂准备和加样应在冰盒中进行。

（4）测定

将反应管放入荧光定量PCR仪内，记录加样顺序。上机前注意反应管是否盖紧，避免泄露污染仪器。

按试剂盒提供的反应条件设置荧光PCR仪，根据探针标记选择荧光通道，开始检测。待检测完毕，判断检测通道有无S型扩增曲线，参照具体仪器使用说明进行基线设定和阈值设定，并读取Ct值。

5.结果判定

（1）质控标准

阴性对照：检测通道无S型扩增曲线。

阳性对照：检测通道有S型扩增曲线且Ct值低于参考值。

如果阳性对照和阴性对照的检测结果均符合上述要求，则实验有效，否则此次实验无效，需重新检测。

（2）结果判定

若样本检测通道Ct值低于参考值，且有S型扩增曲线，则报告该源性成分检测阳性。

若样本检测通道Ct值在参考值之间，则应复检，再根据复检结果另行判断。若样本的Ct值大于参考值或无Ct值且无S型扩增曲线，则报告该源性成分检测阴性。

注：Ct值参考值请参照试剂盒说明书。

二、环介导恒温荧光扩增法（lamp法）

1.原理

基于环介导恒温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP），利用两对特殊引物和具有链置换活性的BstDNA聚合酶，以目标动物的特异性基因片段为靶区域，在恒温条件下（60～65℃）进行连续快速扩增，扩增产物与核酸染料结合发出荧光信号，根据所产生的扩增曲线判断源性成分的有无。

2.仪器及设备

恒温荧光检测仪或荧光定量PCR仪、移液枪（2.5 μL、10 μL、100 μL、1000 μL）、离心机、涡旋混勻器、金属浴、天平（感量0.01 g）。

3.试剂及材料

①商品化动物源性成分检测试剂盒（恒温荧光法）：反应液A（引物、dNTP、离子缓冲液等）、反应液B（酶）、密封液。

②动物组织基因组DNA快速提取试剂盒：试剂A（核酸提取裂解液）、试剂B（PH调节缓冲液）。

③灭菌离心管（1.5 μL或2.0 mL）。

④灭菌PCR反应管（200 μL、100 μL）。

⑤配套灭菌吸头。

⑥冰盒。

4.检测步骤

（1）试样制备

取待检样品200 g（根据实际情况可调整），采用均质器、剪刀等实验器具对样本进行均质处理；称取上述均质样品20mg左右置于1.5 mL离心管内，加入500 μLDNA提取试剂A，震荡混勻，80℃热浴10 min。(www.xing528.com)

取10 μL上清液至新的离心管中，加入1 mL试剂B混勻，备用。

注：DNA提取可使用各试剂盒配套的快速提取试剂，也可采用传统CTAB等核酸提取方法。

（2）扩增试剂准备

从试剂盒中取出反应液A、反应液B、阳性对照品、阴性对照品，待其充分解冻后，振荡混勻5s，离心30s。

根据所要检测的样本数n和各1份阳性对照品与阴性对照品，取（n+2）份的反应液A和反应液B，充分混合后，分装于PCR反应管中，每管加入1滴密封液备用。

（3）加样

在分装有反应液的反应管中分别加入待检样本DNA、阳性对照品、阴性对照品，压紧管盖，涡旋混勻30s，离心1 min。

注1：加样时应使样本完全落入反应液中，不应黏附于管壁上，加样后应尽快压紧管盖。

注2：试剂准备和加样应在冰盒中进行。

（4）测定

将反应管立即放入恒温荧光检测仪或荧光定量PCR仪内，记录加样顺序。上机前注意反应管是否盖紧，避免泄露污染仪器。

按试剂盒提供的反应条件设置相应参数，一般为63℃反应45 min，开始检测。待检测完毕，判断是否有S型扩增曲线。

5.结果判定

（1）质控标准

阴性对照：扩增曲线为直线或轻微斜线，无S型扩增曲线。

阳性对照：呈S型扩增曲线。

如果阳性对照和阴性对照的检测结果均符合上述要求，则实验有效，否则此次实验无效，需重新检测。

（2）结果判定

若样本有S型扩增曲线，则报告该源性成分检测阳性。若样本无S型扩增曲线，则报告该源性成分检测阴性。

注：某些仪器可自动判定结果，直接显示“阴性”或“阳性”。

三、重组酶介导恒温荧光扩增法（RAA法）

1.原理

基于重组酶介导扩增技术（recombinase-aid amplification,RAA），以目标动物的特异性基因片段为靶区域，利用从细菌或真菌中获得的重组酶，在37～39℃条件下与靶标DNA紧密结合，在单链DNA结合蛋白和DNA聚合酶的帮助下，进行连续快速扩增，再利用荧光探针的标记和核酸外切酶酶切实时监控扩增过程，根据所产生的扩增曲线判断源性成分的有无。

2.仪器及设备

恒温荧光检测仪或荧光定量PCR仪、移液枪（2.5 μL、10 μL、100 μL、1000 μL）、离心机、涡旋混勻器、金属浴、天平（感量0.01 g）。

3.试剂及材料

①商品化动物源性成分检测试剂盒（RAA-荧光型）：干粉酶制剂、反应缓冲液、反应催化剂。

②DNA快速提取试剂（核酸提取裂解液）。

③灭菌离心管（1.5 mL或2.0 mL）。

④配套灭菌吸头。

4.检测步骤

（1）样制备

取待检样品200 g（根据实际情况可调整），采用均质器、剪刀等实验器具对样本进行均质处理；称取上述均质样品50 mg左右放入装有0.5 mL核酸提取裂解缓冲液的试剂管中，70℃热浴10 min，中间振摇2～3次，冷却到室温，离心1 min，取上清即为待检样本DNA，备用。

注：DNA提取可使用各试剂盒配套的快速提取试剂，也可采用传统CTAB等核酸提取方法。

（2）加样

向装有干粉酶制剂的检测单元管中加入反应缓冲液，再向检测单元管中分别加入待检样本DNA、阳性对照品、阴性对照品，最后向检测单元管盖上加入反应催化剂，盖上管盖，上下颠倒充分混勻，低速离心10s。

（3）测定

将检测单元管放置于恒温荧光检测仪或荧光定量PCR内，记录加样顺序。上机前注意反应管是否盖紧，避免泄露污染仪器。

按试剂盒提供的反应条件设置参数，一般为39℃反应20 min左右，开始检测。待检测完毕，判断是否有S型扩增曲线，读取出峰时间或Ct值。

5.结果判定

（1）质控标准

阴性对照：无扩增曲线出现，出峰时间或Ct值高于参考值。

阳性对照：有典型的扩增曲线出现，出峰时间或Ct值低于参考值。

如果阳性对照和阴性对照的检测结果均符合上述要求，则实验有效，否则此次实验无效，需重新检测。

（2）结果判断

若样本有典型扩增曲线，且出峰时间或Ct值低于参考值，则报告该源性成分检测阳性。

若样本有典型扩增曲线，但出峰时间或Ct值在参考值之间，则需复检，再根据复检结果另行判断。

若样本出峰时间或Ct值高于参考值且无典型扩增曲线则报告该源性成分检测阴性。

注1：出峰时间或Ct值参考值请参照试剂盒说明书。

注2：某些仪器可自动判定结果，直接显示“阴性”或“阳性”。

6.注意事项

样品采集和制备是动物源性鉴别的重要步骤，为防止交叉污染，尽量使用一次性均质器具，取样时尽量采取肌肉组织，对于同一批样品，应多点采集合并后作为一份样品进行均质。

分子检测容易造成气溶胶污染，为防止污染，实验应分区操作，试剂准备区、样本制备区、扩增及产物分析区之间最好进行物理性隔离，各区域物品不得交叉使用，实验结束后立即清理实验台。

实验过程中应穿戴工作服和乳胶手套，所有使用的离心管、Tip头应高压灭菌，且不含脱氧核糖核酸酶（DNase），实验废弃物密封进行无害化处理。

试剂盒应避光保存，以免荧光物质衰减；试剂使用前要完全解冻，推荐使用前涡旋混勻，短暂离心；试剂应避免反复冻融，可按检测频次将反应液以适当体积分管保存；不同批号试剂请勿混合使用。

本检测结果仅供参考，阳性样确证方法为《食品、化妆品和饲料中牛羊猪源成分检测方法实时PCR法》（SN/T 2051-2008）、《食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法实时荧光PCR法》（SN/T 3730-2013）、《肉及肉制品中动物源性成分的测定实时荧光PCR法》（SB/T 10923-2012报批稿）或最新标准。