有机磷和氨基甲酸酯农药在蔬菜中的快速检测

案例导入

案例：2014年9月18日，沿河中学150多名学生在晚餐进食后，发生腹痛、恶心、呕吐等中毒症状。经化验当天晚餐中的四季豆和青椒含有甲胺磷农药，且含量分别为稻谷中甲胺磷最大残留量的4.7倍和3.2倍。2011年4月27日，青岛连现三起韭菜中毒事件，确认为有机磷类和氨基甲酸醋类农药残留中毒。

讨论：农药残留有什么危害？如何快速检测出果蔬中的农药残留？

农药是防治农作物病虫害、去除杂草、调节农作物生长、实现农业机械化和提高农产品产量和质量的主要措施。化学农药的出现对农业的快速发展起了革命性的推动作用，然而，农业生产者缺乏正确、科学、安全施用农药的科学知识，以及对农药不科学、不系统的认知能力共同催生了农药的乱施滥用，导致农产品中农药残漏超标，进而在食品加工过程中产生农药残漏。

农药的频繁使用使得土壤中富集大量化学物质，进而间接进入生物体组织，并在食物链中不断传递、迁移，从而对害虫及其天敌、水生及土壤生物造成影响，对长期生活在该环境系统中的人类健康构成威胁，同时也对大气环境、水资源造成污染。农药残留对土壤中的微生物、原生动物以及其他的节肢、环节、软体等动物均会产生不同程度的毒性作用，某些高毒、高残留或具有“致畸、致癌、致突变”的“三致”毒性农药通过食物链进入人体后，会参与人体各种生理生化过程，产生病变，破坏体内的酶，影响器官功能，进而导致系统功能紊乱。

目前我国果蔬农产品中农药残留最为严重的是有机磷类和氨基甲酸酯类农药。有机磷农药绝大多数为杀虫剂，如常用的对硫磷、内吸磷、马拉硫磷、乐果、敌百虫及敌敌畏等。有机磷农药对人、畜均有毒性，可经皮肤、黏膜、呼吸道、消化道侵入人体，引起中毒。氨基甲酸酯类农药是在有机磷酸酯之后发展起来的合成农药，具有选择性强、高效、广谱、对人畜低毒的特点。常见氨基甲酸醋类农药有速灭威、西维因、涕灭威、克百威、叶蝉散和抗蚜威等。

一、速测卡法（纸片法）

1.原理

样品中的有机磷和氨基甲酸酯类农药残留经缓冲液提取，有机磷和氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶（白色药片）有抑制作用，抑制胆碱酯酶催化靛酚乙酸酯（红色药片）水解为乙酸与靛酚（蓝色），从而导致速测卡颜色深浅的变化。通过空白颜色比较，对样品中有机磷和氨基甲酸醋类农药进行定性判定。

2.主要仪器、试剂

固化有胆碱酯酶和靛酚乙酸酯试剂的纸片（速测卡）、pH 7.5磷酸盐缓冲溶液、常量天平。

3.检测方法

（1）整体测定法

选取有代表性的蔬菜样品，擦去表面泥土，剪成1cm左右见方碎片，取5 g放入带盖瓶中，加入10 mL缓冲溶液振摇50次，静置2 min以上。

取一片速测卡，用白色药片沾取提取液，放置10 min以上进行预反应，有条件时在37℃恒温装置中放置10 min。预反应后的药片表面必须保持湿润。将速测卡对折，用手捏3 min或在恒温装置恒温3 min，使红色药片与白色药片叠合发生反应。

每批测定应设一个缓冲液的空白对照卡。

（2）表面测定法（粗筛法）

擦去蔬菜表面泥土，滴2～3滴缓冲溶液在蔬菜表面，用另一片蔬菜在滴液处轻轻摩擦。取一片速测卡将蔬菜上的液滴滴在白色药片上，放置10 min以上进行预反应，有条件时在37℃恒温装置中放置10 min。预反应后的药片表面必须保持湿润。将速测卡对折，用手捏3 min或在恒温装置恒温3 min，使红色药片与白色药片叠合发生反应。

每批测定应设一个缓冲液的空白对照卡。

4.结果判定

白色药片区域不变色或略有浅蓝色为阳性结果；白色药片区域变为天蓝色或与空白对照卡相同，为阴性结果。通过对比空白和样品白色药片区域的颜色变化进行结果判定。目视判定亦意图见图4-1。

对阳性结果的样品，可用其他分析方法进一步确定具体农药品种和含量。

图4-1　目视判定示意图

5.速测卡技术指标

灵敏度指标见表4-3。

表4-3　速测卡对部分农药的检出限

6.说明

①本方法所述试剂、试剂盒信息及操作步骤是为给方法使用者提供方便，在使用本方法时不做限定。方法使用者在使用替代试剂、试剂盒或操作步骤前，须对其进行考察，应满足本方法规定的各项性能指标。

②葱、蒜、萝卜、韭菜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇及番茄汁液中，含有对酶有影响的植物次生物质，容易产生假阳性。处理这类样品时，可采取整株（体）蔬菜浸提或采用表面测定法。对一些含叶绿素较高的蔬菜，也可采取整株（体）蔬菜浸提的方法，减少色素的干扰。

③当温度条件低于37℃，酶反应的速度随之放慢，药片加液后放置反应的时间应相对延长，延长时间的确定，应以空白对照卡用手指（体温）捏3 min时可以变蓝为参考，即可往下操作。注意样品放置的时间应与空白对照卡放置的时间一致才有可比性。空白对照卡不变色的原因：一是药片表面缓冲溶液加的少、预反应后的药片表面不够湿润，二是温度太低。

④红色药片与白色药片叠合反应的时间以3 min为准，3 min后的蓝色会逐渐加深，24 h后颜色会逐渐退去。(www.xing528.com)

二、酶抑制率法（分光光度法）

1.原理

在一定条件下，有机磷和氨基甲酸醋类农药对胆碱酯酶正常功能有抑制作用，其抑制率与农药的浓度呈正相关。正常情况下，酶催化神经传导代谢产物（乙酰胆碱）水解，其水解产物与显色剂反应，产生黄色物质，用分光光度计在412n m处测定吸光度随时间的变化值，计算出抑制率，通过抑制率可以判断出样品中是否有高剂量有机磷或氨甲酸醋类农药的存在。

2.主要仪器、试剂

pH 8.0磷酸盐缓冲溶液、5，5-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（显色剂）、碘化乙酰硫代胆碱（底物）、乙酰胆碱酯酶。置4℃冰箱中保存备用，保存期不超过两周。

分光光度计或相应测定仪、常量天平、恒温水浴或恒温箱。

3.检测方法

（1）样品处理

选取有代表性的蔬菜样品，冲洗掉表面泥土，剪成1 cm左右方碎片，取样品1 g，放入烧杯或提取瓶中，加入5 mL缓冲溶液振荡1～2 min，倒出提取液，静置3～5 min，待用。

（2）对照溶液测试

先于试管中加人2.5 mL缓冲溶液，再加入0.1 mL酶液、0.1 mL显色剂，摇匀后于37℃放置15 min以上（每批样品的控制时间应一致）。加人0.1 mL底物摇匀，此时检液开始显色反应，应立即放入仪器比色池中，记录反应3 min的吸光度变化值△A0。

（3）样品溶液测试

先于试管中加人2.5 mL样品提取液，其他操作与对照溶液测试相同，记录反应3 min的吸光度变化值△At。

其检测流程如下：

4.结果计算

（1）结果计算见下式

抑制率（%）=[（△A0-△At）/△A0×l100

式中：△A0—对照溶液反应3 min吸光度的变化值；

△At——样品溶液反应3 min吸光度的变化值。

（2）结果判定

检测结果以酶被抑制的程度（抑制率，%）表示：

当果蔬样品提取液对酶的抑制率≥50%时，表示果蔬中存在高剂量有机磷或氨基甲酸酯类农药，样品为阳性结果。阳性结果的样品需要重复检测两次以上。

对阳性结果的样品，可用其他方法进一步确定具体农药品种和含量。

5.酶抑制率法技术指标

灵敏度指标见表4-4。

表4-4　酶抑制率法对部分农药的检出限

6.说明

①葱、蒜、萝卜、韭菜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇及番茄汁液中，含有对酶有影响的植物次生物质，容易产生假阳性。处理这类样品时，可采取整株（体）蔬菜浸提。对一些含叶绿素较高的蔬菜，也可采取整株（体）蔬菜浸提的方法，减少色素的干扰。

②当温度条件低于37℃，酶反应的速度随之放慢，加入酶液和显色剂后放置反应的时间应相对延长，延长时间的确定，应以胆碱酯酶空白对照测试3 min的吸光度变化△A0值在0.3以上为参考，即可往下操作。注意样品放置时间应与空白对照溶液放置时间一致才有可比性。胆碱酯酶空白对照溶液3 min的吸光度变化△A0值＜0.3的原因：一是酶的活性不够，二是温度太低。