食用油中黄曲霉毒素B1的快速检测技术

案例导入

案例：广州市人民政府网站6月5日发布的《广州市市场监督管理局2020年第13期食品安全监督抽检信息》显示，标称广州市从化街口香润食用植物油加工店生产（供货）的一批次散装称重的花生油黄曲霉毒素B1超标。那么花生黄曲霉毒素B1超标后可能会造成哪些危害？如何采用快速检测方法检测黄曲霉毒素B1呢？

市面上能见到的不少散装食用油，多是一些生产工艺落后、技术含量较低、规模较小、质量管理较差的小企业生产的，产品质量难以保证。而在销售环节，可能存在商户暗自把质量不等、产地不同、生产时间不同的散装油混装，或把质量等级较低的食用油作为散装油出厂，人为地造成散装油质量下降。1993年，世界卫生组织（WTO）癌症研究机构将黄曲霉毒素划定为一类致癌物，是一种毒性极强的剧毒物质。黄曲霉毒素的危害性在于对人及动物肝脏组织有破坏作用，严重时可导致肝癌甚至死亡。在天然污染的食品中以黄曲霉素B1最为多见，其毒性和致癌性也最强。长期食用黄曲霉毒素等超标的食用油，会增大患癌风险。食用油中黄曲霉毒素B1的快速检测主要采用胶体金免疫层析法。

一、胶体金免疫层析法

1.范围

本方法适用于花生油、玉米油、大豆油及其他植物油脂等食用油中黄曲霉毒素B1的快速测定。

2.原理

采用竞争抑制免疫层析原理。样品中的黄曲霉毒素B1经提取后与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制抗体和试纸条或检测卡中检测线（T线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。通过检测线与质控线（C线）颜色深浅比较，对样品中黄曲霉毒素B1进行定性判定。

3.试剂及材料

除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682-2016规定的二级水。

（1）试剂

①十二水磷酸氢二钠。

②二水磷酸二氢钠。

③氯化钠。

④吐温-20。

⑤提取液：30%甲醇水或胶体金免疫层析检测试剂盒专用提取液或根据产品使用说明书配置。

⑥稀释液：称取2.90 g十二水磷酸氢二钠，0.296 g二水磷酸二氢钠，4.50 g氯化钠，溶解于400 mL水中，加入0.5 mL吐温-20，用水稀释至500 mL，混勻即成稀释液；或使用胶体金免疫层析检测试剂盒专用稀释液。

（2）标准溶液的配制

①黄曲霉毒素B1标准储备液（0.1 mg/mL）：精密称取适量黄曲霉毒素B1标准品，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇勻，制成浓度为0.1 mg/mL的黄曲霉毒素B1标准储备液；或可直接购买黄曲霉毒素B1标准储备液。-20℃避光保存备用，有效期3个月。

②黄曲霉毒素B1标准中间液（10 μg/mL）：精密量取黄曲霉毒素B1标准储备液（0.1mg/mL）l-7置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇勻，制成浓度为10 μg/mL的黄曲霉毒素B1标准中间液，临用新制。

（3）材料

黄曲霉毒素B1胶体金免疫层析试剂盒，适用基质为食用油。

①金标微孔（含胶体金标记的特异性抗体）。

②试纸条或检测卡。

（4）仪器及设备

①移液器：100 μL、200 μL和1 mL。

②涡旋混合器。

③离心机：转速≥4000 r/min。

④电子天平：感量为0.01 g。

⑤环境条件：温度15～35℃，湿度≤80%。

4.分析步骤

（1）试样制备

①试样选取。

取适量有代表性样品充分混勻。

②试样提取和净化。

称取1 g油样于离心管中，加入2 mL提取液并混合均勻。漩涡振荡3 min，然后4000r/min离心5 min或静置5～10 min，取下清液备用。

依据检测样品种类及试剂盒说明书，用稀释液将下清液稀释并涡旋混勻，得待测液。

（2）测定步骤

①试纸条与金标微孔测定步骤。

吸取100～200 μL待测液于金标微孔中，抽吸5～10次使混合均勻，尽量不要有气泡，室温温育3～5 min（根据配套说明书进行避光操作）。将检测试纸条样品端垂直向下插入反应微孔中，温育5～10 min，从微孔中取出试纸条，进行结果判定。

②检测卡测定步骤。

吸取100～150 μL待测液滴加到检测卡的加样孔中，温育5～10 min，进行结果判定。

5.质控试验

每批样品应同时进行空白试验和加标质控试验。

（1）空白试验

称取空白试样，按照测定步骤与样品同法操作。

（2）加标质控试验

花生油、玉米油样品：准确称取空白试样100 g（精确至0.01 g），置于100 mL玻璃溶液瓶中，加入200 μL黄曲霉毒素B1标准中间液（10 μg/mL），使试样中黄曲霉毒素B1浓度为20 μg/kg，按照测定步骤与样品同法操作。

其他油脂样品：准确称取空白试样100 g（精确至0.01 g）置于100 mL玻璃溶液瓶中，加入100 μL黄曲霉毒素B1标准中间液（10 μg/mL），使试样中黄曲霉毒素B1浓度为10 μg/kg，按照测定步骤与样品同法操作。

6.结果判定

通过对比质控线（C线）和检测线（T线）的颜色深浅进行结果判定。目视结果判读如图3-3所亦。

图3-3　试纸条/检测卡目视判定示意图

（1）无效

质控线（C线）不显色，表明不正确操作或试纸条检测卡无效。

（2）阳性结果

①消线法。

检测线（T线）不显色，质控线（C线）显色，表明样品中黄曲霉毒素B1含量高于方法检测限，判定为阳性。

②比色法。

检测线（T线）颜色比质控线（C线）颜色浅或几乎不显色，表明样品中黄曲霉毒素B1含量高于方法检测限，判定为阳性。

（3）阴性结果

①消线法。

检测线（T线）、质控线（C线）均显色，表明样品中黄曲霉毒素B1含量低于方法检测限，判定为阴性。

②比色法。

检测线（T线）颜色比质控线（C线）颜色深或者检测线（T线）颜色与质控线（C线）颜色相当，表明样品中黄曲霉毒素B1含量低于方法检测限，判定为阴性。

（4）质控试验要求

空白试验测定结果应为阴性，加标质控试验测定结果应为阳性。

（5）结论

黄曲霉毒素B1与其他几种黄曲霉毒素（黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素M、黄曲霉毒素M2、黄曲霉毒素G、黄曲霉毒素G2）有交叉，当检测结果为阳性时，应对黄曲霉毒素B1结果进行确证。

7.性能指标

①检测限：玉米油、花生油为20 μg/kg；其他植物油脂为10 μg/kg。

②灵敏度：灵敏度应≥99%。

③特异性：特异性应≥90%。

④假阴性率：假阴性率应≤1%。

⑤假阳性率：假阳性率应≤10%。

目标检测

一、单选题

1.酸价是指中和1 g油脂中所含的（）所需要氢氧化钾的质量。

A.过氧化物

B.脂肪酸

C.游离脂肪酸

D.甘油三酸酯

2.显色法测定油脂是酸价加入5 mL异丙醇的目的是（）。

A.使油溶解

B.使显色更明显

C.指示剂的作用

D.使油凝固

3.显色法测定油脂是酸价结果判定方法：若液体颜色变为粉红色并于30s内不褪色说明样品中的酸价值低于标准值，则为（）。

A.阴性(www.xing528.com)

B.阳性

4.显色法测定油脂是酸价，阳性质控试验测定结果应均为（）。

A.阴性

B.阳性

5.显色法测定油脂中的过氧化值时，植物油经有机溶剂溶解后，加入碘化钾与过氧化物反应生成碘单质，用（）标准溶液滴定析出的碘。通过硫代硫酸钠的用量计算样品中过氧化值。

A.硫酸

B.硫代硫酸钠

C.氢氧化钠

D.氯化钠

6.显色法测定油脂中的过氧化值时，加入3 mL冰醋酸，1 g碘化钾，振荡30s，置于暗处反应（）min。

A.1

B.2

C.3

D.4

7.显色法测定油脂中的过氧化值时，用（）作为指示剂。

A.酚酞

B.甲基红

C.甲基橙

D.淀粉

8.试纸比色法测定油脂中过氧化值时，食用植物油中的过氧化物被固化在试纸上的过氧化物酶催化分解出氧，与（）类化合物反应显色，试纸的颜色反映出食用植物油中的过氧化值的量。

A.苯胺

B.联苯胺

C.邻联甲苯胺

D.特丁基对苯二酚

9.芝麻油掺伪的感官鉴别不包括（）。

A.观察法

B.升温法

C.振荡法

D.观色法

10.芝麻油掺伪的感官鉴别中摩擦法更适用于（）。

A.试验室鉴别

B.现场鉴别

11.浓硫酸与芝麻油反应颜色应为（）色。

A.显棕褐色

B.显棕红色

C.显棕黑色

D.显橙黄色

12.蔗糖反应法鉴别芝麻油如果水层显（），则为芝麻油，否则非芝麻油。

A.绿色

B.红色

C.黑色

D.黄色

13.如果食用油脂样品中黄曲霉毒素B1的含量等于或高于检测限，在规定的检测时间内，T线不显色，结果为（）。

A.阳性

B.阴性

C.酸性

D.碱性

14.食用油脂黄曲霉毒素B1检测过程中，如果检测试纸条T线显色，则说明（）。

A.样品中黄曲霉毒素B1的含量低于检测限，结果为阳性

B.样品中黄曲霉毒素B1的含量高于检测限，结果为阳性

C.样品中黄曲霉毒素B1的含量高于检测限，结果为阴性

D.样品中黄曲霉毒素B1的含量低于检测限，结果为阴性

15.食用油脂黄曲霉毒素B1检测过程中，如果质控线（C线）不显色，则说明（）。

A.黄曲霉毒素B1的含量太高

B.黄曲霉毒素B1的含量太低

C.检测有效

D.检测无效

16.食用油脂黄曲霉毒素B1检测过程中，试样提取和净化过程中离心的转速和时间是（）。

A.4000 r/min、5 min

B.3000 r/min、3 min

C.2000 r/min、5 min

D.1000 r/min、3 min

二、多选题

1.试纸比色法测定油脂酸价结果判定方法为：观察试纸条的颜色，与标准色阶卡进行比较，判定检测结果。颜色（）的色块下的数值即是本样品的检测值，如试纸的颜色在两色块之间，则取两者的中间值。

A.相同

B.相近

C.不同

D.不近

2.过氧化值表示（）等被氧化程度的一种指标。是1千克样品中的活性氧含量，以过氧化物的毫摩尔数表示。

A.蛋白质

B.碳水化合物C.油脂

D.脂肪酸

3.不法商贩在芝麻油中掺入（）等低价食用植物油脂，也有在香油中掺入米汤等。

A.棉籽油

B.卫生油

C.玉米胚油

D.菜籽油

4.检测试纸条可能出现几种结果？（）

A.C线，T线同时显色，结果为阴性

B.C线显色，T线不显色，结果为阳性

C.C线，T线同时不显色，结果为检测无效

D.C线不显色，T线显色，结果为检测有效

答案及解析

一、单选题

1.C 2.A 3.A 4.B 5.B 6.C 7.D 8.B 9.B 10.B 11.C 12.B 13.A 14.D 15.D 16.A

二、多选题

1.AB 2.CD 3.ABCD 4.ABC