案例导入
案例：2021年1月13日，河北省市场监督管理局公布，近期市场监管部门在石家庄市场抽检了粮食加工品，乳制品，食用农产品，食用油、油脂及其制品，肉制品5类162批次样品，检测合格161批次，不合格1批次。不合格样品为：桥西区张波粮油经销处销售的玉米面，检测出玉米赤霉烯酮不符合食品安全国家标准规定。
那么什么是玉米赤霉烯酮？玉米赤霉烯酮究竟有什么危害？如何采用快速检测方法检测玉米赤霉烯酮呢？
玉米赤霉烯酮（Zearalenone,ZEN）又称为F-2毒素，主要是由禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌、木贼镰刀菌、雪腐镰刀菌等菌种产生的有毒代谢产物，主要存在于易受到真菌污染的玉米、小麦、高粱、大米等谷物中。ZEN侵染作物主要发生在作物的耕作、收获、运输和贮存期间，在温度适中而湿度较高的环境中滋生镰刀菌，由镰刀菌产毒所致。玉米赤霉烯酮具有生殖发育毒性和免疫毒性，与肿瘤发生也有一定联系，被国际癌症研究中心归类为3类致癌物。有研究显示，中国人群暴露ZEN的风险较低，其中3～13岁儿童为高风险人群，需引起关注。
玉米赤霉烯酮主要污染玉米、小麦、大米、大麦、小米和燕麦等谷物，其耐热性较强，110℃下处理1小时才被完全破坏。GB 2761-2017《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》规定，玉米赤霉烯酮在玉米面（渣、片）中的限量为≤60 μg/kg。食用玉米赤霉烯酮超标的食品可能会引起中枢神经系统的中毒症状，如恶心、发冷、头痛等。造成玉米赤霉烯酮超标的原因可能是原料质量较差，在生长时受镰刀菌属菌株污染；或者是原料、成品储运不当导致镰刀菌属菌株快速繁殖，造成玉米赤霉烯酮超标。
一、比色法
1.范围
本方法规定了食品中玉米赤霉烯酮快速检测胶体金免疫层析法。
2.原理
本方法采用竞争抑制免疫层析原理。样品中的玉米赤霉烯酮经提取后与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制抗体和试纸条中检测线（T线）上的抗原结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。通过检测线（T线）与质控线（C线）颜色深浅的比较，对样品中玉米赤霉烯酮进行结果判定。
3.试剂及材料
乙腈、甲醇水溶液（7：3，体积比）、稀释缓冲液（胶体金免疫层析检测试剂盒专用提取液或根据产品使用说明书配置）、玉米赤霉烯酮、玉米赤霉烯酮胶体金免疫层析试剂盒（适用基质为玉米、小麦及其碾磨加工品）。
4.仪器及设备
移液器（100 μL、200 μL、1 mL和5 mL）、旋祸混合器、离心机、电子天平。
5.分析步骤
（1）标准溶液的配制
①标准储备液：称取适量标准品，用乙腈溶解，配制成浓度为100 μg/mL的标准储备液。-18℃避光保存，有效期6个月。
②标准工作液：准确量取标准储备液（100 μg/mL）100 μL，置于10 mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇勻，制成浓度为1 μg/mL的玉米赤霉烯酮标准工作液，2～8℃避光保存，有效期1个月。
（2）测定条件
环境温度：20～30℃。
空气相对湿度：最佳测定湿度45%～65%。若湿度低于45%，相应延长待测液与试纸条反应时间，以质控实验为准；若湿度为65%～80%，微孔与试纸条拆开后立即使用，避免微孔与试纸条长时间暴露在空气中受潮；避免在湿度80%以上湿度进行实验。
（3）试样制备
按GB/T 5491-1985扦取的样品充分碾磨或粉碎混勻，过40目筛。
（4）提取
准确称取试样5.0 g（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，加入20 mL甲醇水溶液，用旋涡混合器振荡3 min，离心分层或静置分层，上清液备用。
准确移取0.8 mL稀释缓冲液于1.5 mL离心管中，加入25 μL上清液，混勻，待检。
（5）测定步骤
依检测所需，取相应数量的金标微孔和试纸条，做好标记。吸取待检液200 μL于金标微孔中，抽吸至孔底的紫红色颗粒完全溶解，孵育10 min。将试纸条插入金标微孔中，反应3〜5 min。
从金标微孔中取出试纸条，弃去试纸条下端的样品垫，观察显色情况，进行结果判定。若试剂盒冷藏保存，使用前需恢复至实验环境温度。
6.质控试验
每批样品应同时进行空白试验和阳性质控试验，可根据检测样品量制定适宜频次的质控试验。
（1）空白试验
①试剂空白试验：除不称取试样外，均按上述所述步骤操作。
②基质空白试验：准确称取空白试样，均按上述所述步骤操作。
（2）阳性质控试验
准确称取玉米赤霉烯酮含量为60 μg/kg的质控样，按上述步骤操作。或准确称取空白试样，加入一定体积的玉米赤霉燦酮标准工作液，使玉米赤霉烯酮添加量为60 μg/kg，按上述步骤操作。
7.结果判定
通过对比控制C线和检测T线的颜色深浅进行结果判定。
（1）无效结果
无论样品中有无玉米赤霉烯酮存在，控制C线均会出现一条紫红色条带。若C线未显色，表明操作不正确或试纸条已失效，检测结果无效（见图2-4）。
图2-4 试纸条目视判定图
（2）阳性结果
控制C线显色，检测T线显色比C线浅或者没有颜色，判定为阳性（见图2-5）。
（3）阴性结果
控制C线显色，检测T线显色比C线深或者一致，判定为阴性（见图2-5）。
图2-5 试纸条目视判定图
（4）质控试验要求
空白试验结果应为阴性，阳性质控试验结果应为阳性。
二、消线法
1.范围(www.xing528.com)
本方法适用玉米、小麦及其碾磨加工品中玉米赤霉烯酮快速筛选测定。
2.原理
本方法采用竞争抑制免疫层析原理。样品中的玉米赤霉烯酮经提取后与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制抗体和试纸条中检测线（T线）上的抗原结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。通过T线显色与否进行结果判定。
3.试剂及材料
同比色法。
4.仪器及设备
同比色法。
5.环境条件
环境温度：10～40℃。
空气相对湿度：同比色法。
6.分析步骤
（1）样制备
同比色法。
（2）提取
准确称取试样5.0 g（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，加入12.5 mL甲醇水溶液，用旋涡混合器振荡3 min，离心分层或静置分层，上清液备用。
准确移取400 μL稀释缓冲液于1.5 mL离心管中，加入上清液（小麦50 μL，玉米80 μL），混匀，待测。
（3）测定步骤
同比色法。
7.质控试验
每批样品应同时进行空白试验和阳性质控试验，可根据检测样品量制定适宜频次的质控试验。
（1）空白试验
①试剂空白试验：除不称取试样外，均按上述所述步骤操作。
②基质空白试验：准确称取空白试样，均按上述所述步骤操作。
（2）阳性质控试验
准确称取玉米赤霉烯酮含量为60 μg/kg的质控样，按上述步骤操作。或准确称取空白试样，加入一定体积的玉米赤霉烯酮标准工作液，使玉米赤霉烯酮添加量为60 μg/kg，按上述步骤操作。
8.结果判定
通过观察检测T线显色与否进行结果判定。
（1）无效
同比色法。
（2）阳性结果
控制C线显色，检测T线不显色，判定为阳性（见图2-6）。
（3）阴性结果
控制C线显色，检测T线显色，判定为阴性（见图2-6）。
图2-6 试纸条目视判定图
9.质控试验要求
同比色法。
三、读数仪法
具体检测步骤及结果判定可参考相应的说明书操作，质控试验参照第一法与第二法。
1.结论
本方法筛查出的阳性样品进行确认时，应按GB 2761-2017指定方法标准检测并判定。
2.性能指标
①检出限：60 μg/kg。
②灵敏度：灵敏度应≥95%。
③特异性：特异性应≥90%。
④假阴性率：假阴性率应≤5%。
⑤假阳性率：假阳性率应≤10%。
3.其他
本方法所述试剂、试剂盒信息及操作步骤是为了方便方法使用者，在使用本方法时不做限定。方法使用者在使用替代试剂、试剂盒或操作步骤前，须对其进行考察，满足本方法规定的各项性能指标时方可使用。
本方法参比的标准为GB 5009.209-2016《食品安全国家标准食品中玉米赤霉烯酮的测定》。
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