离子液体荧光猝灭在血红蛋白诱导中的应用

实验中测定了血红蛋白、白蛋白、细胞色素C、转铁蛋白、铜蓝蛋白等蛋白质对离子液体的荧光猝灭情况。结果表明，血红蛋白能明显地猝灭离子液体的荧光，而白蛋白、细胞色素C、转铁蛋白、铜蓝蛋白对离子液体的荧光无猝灭现象。实验中测定了当存在血红蛋白时，离子液体BmimPF6、BBimPF6、BtmsimPF6的荧光光谱，如图6-8所示，激发波长为344nm，激发和发射波长的狭缝宽度均为10nm，灯电压为500V。以344nm波长的激发光激发离子液体时，离子液体在420nm处有明显的荧光发射；当离子液体溶液中加入一定浓度的血红蛋白后，其荧光被血红蛋白猝灭，但猝灭程度不同，对BBimPF6的荧光猝灭程度最大，而对BmimPF6的荧光猝灭程度最小，同时离子液体的最大发射波长也明显向长波方向移动。

图6-8　血红蛋白存在时不同离子液体的荧光光谱

a—BBimPF6饱和水溶液　b—BtmsimPF6饱和水溶液　c—BmimPF6饱和水溶液　d—血红蛋白浓度为100ng/μL的BBimPF6饱和水溶液　e—血红蛋白浓度为100ng/μL的BtmsimPF6饱和水溶液　f—血红蛋白浓度为100ng/μL的BmimPF6饱和水溶液

6.3.2.1　荧光猝灭类型

在第四章中，离子液体萃取血红蛋白的机理研究已证明，离子液体的咪唑阳离子与血红蛋白的铁原子发生配位。因此，血红蛋白诱导离子液体荧光猝灭的类型被认为可能是静态猝灭。即当离子液体与血红蛋白接触后，形成了一种无荧光或荧光很弱的基态配合物。为了证实血红蛋白诱导离子液体的荧光猝灭类型，实验中测定了不同温度时的Stern-Volmer方程及离子液体与血红蛋白体系的吸收光谱等。

6.3.2.2　静态猝灭

实验中测定了纯离子液体BBimPF6饱和水溶液和溶解了血红蛋白的离子液体饱和水溶液的荧光光谱，如图6-9所示。当采用344nm的激发光激发时，离子液体饱和水溶液的相对荧光强度为2765，最大荧光发射波长为421nm；而当离子液体饱和水溶液中加入100ng/μL的血红蛋白后，相对荧光强度减小到1650，最大荧光发射波长亦红移到435nm。这主要是由于血红素基团中的铁原子与处于基态的离子液体阳离子中氮原子发生配位[26]，形成的基态配合物荧光强度及发射波长都发生改变，从而导致离子液体的荧光被猝灭，因此，血红蛋白对离子液体的荧光猝灭过程可能是静态猝灭。

图6-9　纯BBimPF6饱和水溶液以及存在100ng/μL的血红蛋白时BBimPF6饱和水溶液的荧光光谱

6.3.2.3　动态猝灭

实验中，分别测定了20℃和40℃时，不同浓度的Hb对离子液体的荧光猝灭程度，以血红蛋白浓度对相对荧光比（F0/F）作图得到图6-10。根据Stern-Volmer方程：F0/F=1+Kqτ0CHB=1+KsvCHB，Ksv=Kqτ0，可以计算出20℃和40℃时的Stern-Volmer常数Ksv分别为：3.871×105L/mol和3.543×105L/mol。这个结果表明，在不同温度下获得的常数Ksv几乎相同，因此，可以推断血红蛋白对离子液体的荧光猝灭不是动态猝灭。

6.3.2.4　能量转移猝灭

当荧光分子发射的荧光波长与猝灭剂的吸收波长发生重叠时，发射出的荧光可能会被猝灭剂所吸收，从而导致荧光猝灭。因此，实验中测定了离子液体BBimPF6的荧光发射波长和血红蛋白的吸收波长，如图6-11所示。当采用344nm的激发光激发离子液体BBimPF6时，荧光发射波长范围为370～500nm，而血红蛋白在350～440nm波长范围内有明显的光吸收，因此可以推断出，当血红蛋白加入离子液体水溶液中后，离子液体发射出的370～500nm波长的荧光可能被血红蛋白吸收，部分

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图6-10　不同温度下的Stern-Volmer方程

图6-11　100ng/μL血红蛋白吸收光谱与BBimPF6离子液体饱和水溶液的荧光光谱

离子液体饱和水溶液3mL，血红蛋白浓度100ng/μL。能量转移到血红蛋白中，从而导致其荧光强度降低。所以，血红蛋白对离子液体的荧光猝灭可能存在着能量转移猝灭。

6.3.2.5　猝灭机理

基于以上研究认为，血红蛋白对离子液体的荧光猝灭类型可能是静态猝灭和能量转移猝灭，其猝灭机理被推测可能包含以下两个方面。

（1）血红蛋白中血红素的铁原子与离子液体咪唑阳离子发生配位结合形成了一种基态配合物，在这个基态配合物中铁原子是顺磁性的[26]，因此产生可逆性的电荷转移作用而导致离子液体的荧光猝灭[1]。

（2）血红蛋白中的血红素分子在350～440nm波长范围内对光有强光吸收，离子液体发射出的370～500nm波长范围内的荧光被血红蛋白所吸收，部分能量转移到血红蛋白分子中，从而导致离子液体荧光猝灭。

6.3.2.6　荧光猝灭法测定血红蛋白的方法性能分析

图6-12　不同浓度血红蛋白对离子液体BBimPF6饱和水溶液荧光的猝灭情况

1—0 2—15ng/μL　3—30ng/μL　4—45ng/μL　5—60ng/μL　6—75ng/μL　7—90ng/μL

通过以上荧光猝灭实验研究可以看出，血红蛋白能猝灭离子液体的荧光。基于此，以离子液体BBimPF6作为荧光探针，考察不同浓度血红蛋白对离子液体的荧光猝灭情况，饱和离子液体水溶液体积为3mL，血红蛋白浓度为0～90ng/μL，激发波长为344nm，发射波长为421nm，激发和发射波长的狭缝宽度均为10nm，灯电压为500V。分别测定在0、15ng/μL、30ng/μL、45ng/μL、60ng/μL、75ng/μL、90ng/μL血红蛋白存在条件下，BBimPF6饱和水溶液的荧光强度，如图6-12（a）所示。从图中可以看出，随着溶液中血红蛋白浓度的增大，离子液体的荧光强度降低。以血红蛋白浓度为横坐标，以荧光强度变化量（ΔF=F0-F）为纵坐标，得到一线性方程：ΔF=15.574CHb+51.179，R2=0.9903，如图6-12（b）所示。该方法的线性范围为15～100ng/μL，检出限为5.0ng/μL，相对标准偏差RSD为3.2%（50ng/μL，n=11）。