离子液体在核酸和蛋白质分离中的研究结果

通过以上实验可以看出，在无任何其他辅助萃取剂的条件下，离子液体BmimPF6可以实现对DNA的萃取。离子液体BmimPF6是一种疏水性离子化合物，在水中的溶解度约为18g/L[11]，因此当DNA水溶液与离子液体混合时，部分离子液体溶解在水中并电离出Bmim+阳离子和阴离子。Bmim+阳离子与电负性的DNA发生静电作用或配位键合反应作用。另外，由于离子液体是疏水性的，因此当剧烈震荡时，离子液体在水中形成微珠，离子液体与水相之间接触面积增大，在两相接触界面上大量Bmim+阳离子可以与水相中的DNA发生相互作用。

在中性水溶液中，DNA以聚阴离子形式存在，其磷酸基团中的磷原子有高能量的d轨道和较大的有效原子半径，使磷原子有较大的极化度和较小的电负性，而且由于磷原子直接和烷氧基（RO-）相连，电子效应的影响较为强烈，从而使磷酸根上的羟基容易电离出氢离子。而氧原子由于有孤对电子而表现出较强的电负性，容易与溶液中带正电荷的Bmim+阳离子发生相互作用。

另外，在离子液体萃取DNA过程中，也可能发生离子交换反应，即水溶液中的DNA聚阴离子与离子液体阴离子发生离子交换，从而促使DNA从水溶液中转移到离子液体中。

基于实验结果与理论分析，我们认为，DNA能够从水溶液中直接被萃取到离子液体中，其可能机理是DNA分子中磷酸基团上带负电荷的氧原子与溶解在水中的咪唑阳离子Bmim+发生了键合反应作用，从而使DNA萃取到离子液体中去。其机理示意如图2-6所示。

图2-6　离子液体阳离子Bmim+与DNA磷酸基团相互作用的示意图

2.3.6.1　31P核磁共振光谱测定

从上述提到的萃取机理可以看出，如果DNA分子中磷酸基团上带负电荷的氧原子与溶解在水中的咪唑阳离子Bmim+发生了键合反应作用，那么当DNA被萃取到离子液体中后，在DNA分子中就会存在P—O—Bmim化学键，而且P—O键的化学环境及电子结构都会发生变化，因此，实验中采用核磁共振光谱证明DNA分子在萃取前、后的结构变化。由于DNA相对分子质量较大，而且结构复杂，从1H谱和13C谱无法确定其结构的改变，而DNA分子骨架中含有磷酸基团，因此，本实验中采用31P核磁共振光谱进行分析。

实验中以85%的磷酸为内标物，测定了离子液体、标准DNA样品和DNA与离子液体混合作用后混合样品的31P核磁共振光谱，如图2-7所示。由于离子液体中含有，测得其化学位移为-130.17～-143.34ppm（未标出），而内标物磷酸的化学位移为0.0ppm，如图2-7曲线a所示。标准DNA样品的化学位移为-0.72ppm，如图2-7曲线b所示。与磷酸的化学位移相比，DNA分子中磷的化学位移明显向高场移动，这表明在DNA分子中磷原子的电子云密度小于磷酸分子中磷原子[15-16]。这主要是由于在磷酸分子中，三个氧原子都是与氢原子结合的，而在DNA分子中，一个氧原子与氢连接，而另外两个氧原子与吸电子能力更强的烷基相连，与磷酸相比DNA分子中磷原子的电子云密度降低，因此导致其核磁共振化学位移向高场移动，这个测定结果与它们的分子结构是明显一致的。

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图2-7　31P-NMR光谱（in　DMSO）

a—BmimPF6　b—Na-DNA　c—DNA-BmimPF6
数据采集频率为242.96MHz，数据采集点数为32，扫描范围为-100～100ppm，85%的磷酸作为内标。

当DNA被萃取到离子液体中后，测定得到核磁共振谱如图2-7曲线c所示。可以看到萃取了DNA后的离子液体的化学位移为-0.94ppm，与DNA的化学位移-0.72ppm相比，明显向高场移动，这表明在萃取后的离子液体中，DNA分子中磷原子电子云密度与标准DNA样品相比有所降低，而这个降低主要是由于DNA的磷酸基团中的氧原子与吸电子基团Bmim+发生了作用。在离子液体相中，当离子液体的阳离子Bmim+与DNA的磷酸基团氧原子发生键合反应后，DNA分子中的三个氧原子分别与吸电子能力强的烷基和Bmim+结合，导致磷原子电子云密度降低。对比磷酸、标准DNA样品及DNA与离子液体的混合样品的31P核磁共振谱，可以看出其结果与所推测的萃取机理是一致的，这个结果证明在萃取过程中，DNA的磷酸基团与离子液体的Bmim+发生键合反应，确实存在P—O—Bmim化学键。

2.3.6.2　红外光谱测定

图2-8所示为400～4000cm-1范围内DNA、BmimPF6及DNA-Bmim加合物的红外光谱。图2-8曲线a为DNA的红外光谱图，从图中可以看出DNA分子在3434cm-1、2920cm-1、1680cm-1、1238cm-1、1090cm-1有明显的吸收峰；3434cm-1处的吸收峰为N—H、O—H键的特征峰，2920cm-1为CH2的C—H键的特征峰，1680cm-1为C==O键的特征峰，1238cm-1、1090cm-1为—P—O、—P==O键的特征峰[17-18]。图2-8曲线b为离子液体BmimPF6的红外光谱图，分别在3040cm-1、2940cm-1、1668cm-1、1338cm-1、1190cm-1、877cm-1有明显的吸收峰。其中3040cm-1、2940cm-1为CH2、CH3中C—H键的特征峰。图2-8曲线c为DNABmim加合物的红外光谱图，分别在3434cm-1、3040cm-1、2940cm-1、2920cm-1、1680cm-1、1668cm-1、1190cm-1、877cm-1有明显的吸收峰。对比图2-8曲线a与图2-8曲线c可以看出，其3434cm-1、2920cm-1处DNA的N—H、O—H键的特征峰在DNA-Bmim加合物中明显存在，这表明DNA分子确实存在于加合物中，然而，DNA的—P—O、—P==O键在1238cm-1、1090cm-1的特征峰却明显消失，不存在于DNA-Bmim加合物的红外光谱中。

图2-8　FI-IR光谱（KBr压片）

a—500ng/μL鲑鱼DNA钠盐　b—BminPF6　c—离子液体中 DNA-BminPF6加合物

有文献报道，当DNA分子的磷酸基团与Co2+、Cu2+、Mn2+、Ca2+、Mg2+等金属离子相互作用时，双键的极性会显著增加，从而导致双键的伸缩振动和弹性振动特征吸收峰的位置移动和强度改变[18-21]。Cu2+能够显著的增强双键的伸缩振动、弹性振动的吸收强度，而Ca2+、Mg2+却能显著的降低双键的吸收强度，这种改变被认为可能是DNA的构型在A型和B型之间发生改变[19]。对于A型DNA分子，其红外光谱在1238cm-1、1090cm-1有明显的特征峰，而对于B型DNA分子，其红外光谱在1238cm-1、1090cm-1没有特征吸收峰[18]，因此，结合实验中测得的红外光谱图，认为在DNA-Bmim加合物中DNA的构型与标准DNA样品相比，发生了明显的变化，这是由于离子液体的阳离子Bmim+与DNA的P—O键发生键合反应，从而引起DNA的构型发生改变，导致其红外光谱中1238cm-1、1090cm-1特征吸收峰的消失。