动物分子育种技术：遗传改良、转基因、克隆|生物技术与工程概论

优良品种在养殖生产中占有极其重要的地位，这也是人们不断进行品种改良的主要原因。动物品种改良的基础包括遗传理论、育种技术及种质资源。因此，在种质资源存在的条件下，育种技术决定了品种改良的进度，但育种技术的进步又依赖于遗传理论的发展。遗传学应用于指导动物育种，经历了经典遗传学、群体遗传学、数量遗传学，发展到现在的分子数量遗传学；育种技术也经历了表型选种、表型值选种、基因型值或育种值选种，发展到以DNA分子为基础的标记辅助选种、转基因技术和基因诊断试剂盒选种等分子育种技术。

与动物育种有关的现代生物技术包括动物转基因技术、胚胎工程技术、动物克隆技术及其他以DNA重组技术为基础的各种技术。按照常规育种方法要改变家养动物的遗传特性，如增重速率、瘦肉率、饲料利用率、产奶量等，人们往往需要进行多代杂交或近交，固定优良性状，最后培育出人们期望的高产、优质的品种。目前，大多数生产上所用的品种都是用这种交配与选择相结合的传统动物育种的方法选育出来的。然而，这种育种方法所需时间长，品种育成后引入新的遗传性状困难较大。由于带有新性状的品种可能同时也携带有害基因，杂交后有可能会降低原有性状，因此又需要重新进行多代杂交和严格选择。多年来，杂交选择一直是改良动物遗传性状的主要途径。但是，随着现代生物技术的发展，传统的杂交选择法的各种缺陷日益明显，而现代分子育种技术却显示出越来越强大的生命力.逐渐成为动物育种的趋势和主流。通过各种现代生物技术的综合运用，结合传统的育种方法，可以大大加快育种进展。例如，利用DNA导入细胞的技术，通过胚胎工程，科学家们可以把单个有功能的基因或基因簇插入高等生物的基因组中去，并使其表达，再通过有关分子生物学技术加以选择，从而获得具有目标性状的个体，培育出新品种。

（一）动物转基因技术

（1）动物转基因技术的基本原理。动物转基因技术是在基因工程、细胞工程和胚胎工程的基础上发展起来的。将外源基因导入动物的基因组并获得表达，由此产生的动物称为转基因动物（transgenic animal）。转基因技术利用基因重组打破动物的种间隔离，实现动物种间遗传物质的交换，为动物性状的改良或新性状的获得提供了新方法。1982年，美国华盛顿大学Palmiter教授等将大白鼠生长激素基因转移到小白鼠的受精卵中，成功地育成个体比正常小白鼠大1倍的超级小鼠，开创了转基因动物研究的先河。作为基因工程技术之一，动物转基因同样需要目的基因、合适的载体和受体细胞。由于动物细胞有别于植物细胞，绝大多数不具备发育的全能性，不能发育成为完整的个体，只有受精卵才可能发育成个体，因此要得到转基因动物还需要细胞工程和胚胎工程技术的配合。动物转基因的步骤：外源基因的获得与鉴定；外源基因导入受精卵；转基因受精卵移植到母体子宫；胚胎发育；检测新基因的遗传性表达能力。

导入外源基因的方法主要有：①显微注射法。这是使用最早、最常用的方法。这种方法用显微注射器直接把外源DNA注射到受精卵细胞的原核或细胞质中。如果能够成功地把DNA注射到原核中，可以得到较高的整合率。注射到细胞质的DNA因为与受体基因组结合的机会较少，所以整合率较低。哺乳动物常用注射原核的方法，鱼类和两栖类的卵是多黄卵，难以在显微镜下辨认原核，通常只能把DNA注射到细胞质。也有人采用注射卵母细胞的方法制作转基因鱼，先把外源DNA注射到卵母细胞，再让卵母细胞在体外成熟，然后受精。显微注射法的优点是直观，基因转移率高，外源DNA长度不受限制，实验周期相对较短，常常成为导入外源基因的首选技术。不足之处是操作难度大，仪器要求高，导入的外源基因拷贝数无法控制。②病毒载体法。许多动物病毒在感染宿主细胞后会重组到宿主的基因组中。更重要的是动物病毒基因组的启动子能被宿主细胞识别，可以引发导入基因的表达。由于这些特征，一些病毒被选择作为目的基因的载体感染动物细胞，以期得到转染细胞。在转基因操作中，病毒载体可以直接感染着床前或着床后的胚胎，也可以先整合到宿主细胞内，再通过宿主细胞与胚胎共育感染胚胎。最常用的病毒载体是反转录病毒（retro Virus）。病毒载体的优点是单拷贝整合，整合率高，插入位点易分析等；缺点是安全性和公众的接受程度还有待评价。③脂质体介导法。用脂质体作为人工膜包裹DNA，以此作为载体将外源DNA导入细胞。④精子介导法。成熟的精子与外源DNA共育，精子有能力携带外源DNA进入卵里，并使外源DNA整合到染色体。这种能力使人们看到提高动物转基因效率的希望。精子作为转移载体的机制还在探索之中，但至少为大型动物转基因的研究又提供了一个新途径。⑤胚胎干细胞法。胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES细胞）是早期胚胎的内细胞团经体外培养建立起来的多潜能细胞系，被公认为转基因动物、细胞核移植、基因治疗的新材料，具有广泛的应用前景。用于动物转基因时，作为基因载体，导入早期胚胎，可以整合到胚胎中参与发育，形成转基因的嵌合体动物。

（2）转基因技术在动物生产上的应用。最早问世的转基因动物是转基因小鼠。转基因小鼠证明了生物技术可以改变动物的天然属性，从而显示了动物转基因技术的广阔前景。转基因技术应用于农业动物的主要目标是提高生产性能，提高抗病性等。除此之外，近年来用转基因动物作为生物反应器的研究越来越受到人们的重视，已逐步走向商品化生产。目前，已有转基因鱼、鸡、牛、马、羊、猪等多种动物成功的报道。

①转基因鱼。20世纪80年代中期，国内外开始了转基因鱼的研究，转基因鱼是迄今为止最成功的转基因动物之一。鱼类因其产卵量大，体外受精、体外孵化等特点，大大简化了转基因操作的步骤。1984年，我国学者朱作言首次用人的生长激素基因构建了转基因金鱼，目前已有鲫鱼、鲤鱼、泥鳅、鳟鱼、大马哈鱼、鲶鱼、罗非鱼、鲂等各种淡水鱼和海水鱼被用于转基因研究。转基因鱼的生产性研究主要集中在提高生长速率和抗逆性，在理论方面则为动物发育机制和基因功能研究提供方法。生长激素能提高动物的生长速率，已经有转生长激素基因鲤鱼明显提高了生长速率，显示出转基因鱼在渔业生产和水产养殖业的潜在经济价值。在提高抗性方面，抗冻蛋白基因被用来提高鱼类的抗寒能力。转抗冻蛋白基因技术有可能成为南鱼北养，扩大优质鱼种养殖范围的有效途径。转基因鱼研究还引进了反义RNA技术，有可能开辟鱼类抗病新途径。近年来，陆续有转荧光蛋白基因的转基因鱼问世，成为培育观赏鱼和环境污染检测用鱼新品种的有效技术。我国的转基因鱼研究已达到国际先进水平，由朱作言领导的研究组率先构建了由鲤鱼和草鱼基因组件组成的“全鱼”基因载体，并培育出快速生长的转“全鱼”基因黄河鲤鱼；建立了鱼类基因打靶定点整合技术。使用鱼类自身基因元件构建“全鱼”基因载体，可以解决基因表达强度问题和推广转基因鱼的环境问题、伦理道德问题，在转基因鱼生产性应用中具有重要意义。

②转基因家禽。生产转基因动物的常规操作用于家禽是很困难的。这是因为鸟类的繁殖系统有别于其他动物。家禽卵的受精是在排卵时发生的，受精卵从输卵管排出需要20多个小时，当时已经开始卵裂，产出时的卵已有6000多个细胞。转基因家禽研究主要集中在转基因鸡。生产转基因鸡的方法可分为蛋产出前的操作和产出后的操作两种类型。蛋产出前的操作方法是在受精后第一次卵裂前取出单细胞的卵，在体外进行转基因操作，然后用代用蛋壳作为培养器皿在体外培养至孵化。英国学者Perry和Sang等用这种方法，体外显微注射外源DNA，获得转基因鸡。这种操作方法类似于杀鸡取卵，一个受精卵的成本是一只母鸡，而且转基因后受精卵需用人工蛋壳孵化，条件也很复杂，成本高，难度大。美国北卡州立大学的Mozdziak和Petitte则采用蛋产出后操作方法，以反转录病毒为载体将外源基因注射到产出后的受精卵，孵化后也得到转基因鸡。蛋产出后的操作方法可有多种，被认为较有前景的是胚胎干细胞法和原生殖细胞（primordial germ cell，PGC）法。原生殖细胞是鸟类配子的前体，实验证明，原生殖细胞可以被从一个胚胎转到另一个胚胎发育。这两类细胞可以先在体外进行转基因操作，然后再导入鸡胚，得到转基因嵌合体，再进一步纯合得到完全转基因动物。由于家禽人工授精技术已经相当成熟，精子携带基因具有很好的可行性，不少研究者正在探讨以鸟类精子作为转基因载体的途径，有待解决的问题是提高精子携带外源DNA的能力。

转基因技术在家禽生产上的应用，同样以提高抗病性和改良生产性状为主要目标之一。例如，用鼠的抗流感病毒基因Mx 1导入鸡胚的成纤维细胞，细胞表现出了对流感病毒的抗性，提示了Mx 1基因导入胚胎细胞产生抗病性的可行性。许多与鸡繁殖和生产有关的激素和生长因子基因已经被克隆，已有人将牛生长激素基因导入鸡的品系，获得高水平表达牛生长激素的鸡，体重大于对照组。因此，通过基因操作改变鸡的生产性状是可能的。对某些可以通过常规育种手段改良的性状，通过转基因方法，如导入其他物种的基因或许更有效。此外，鸡作为生物反应器具有突出的优点：①对鸡自身具有安全性。鸡的输卵管是一个自我封闭的系统，输卵管的漏斗部、膨大部分泌蛋白质，分泌的蛋白质不会再回到血液中去，这样可以避免输卵管表达的外源性蛋白质对鸡健康造成危害；②鸡的输卵管是有效的蛋白质合成器，卵清蛋白启动子可调控其下游的外源基因的表达，合成的基因产物可进行正确的修饰和加工，产物的生物活性接近天然产品；③鸡输卵管表达外源蛋白质具有遗传稳定性，一旦获得可生产有价值蛋白质的动物个体，可用常规畜牧技术建立转基因鸡的家系。鸡作为生物反应器还具有哺乳动物所不具有的优点：①产物易收集，且不易污染；②鸡蛋成分简单，产物易分离；③鸡饲养成本低，世代间隔短。用鸡蛋生产珍贵的药物外源蛋白质，是转基因鸡生产的一个十分诱人的领域。

③转基因家畜。家畜的转基因研究得益于小鼠的有关实验，进展较快。转基因猪、牛、马、羊、兔等家畜纷纷出现，并逐步走出实验室进入实用阶段。哺乳动物体外受精和胚胎移植技术为转基因家畜的成功提供了有效的技术手段。转基因家畜除了与其他转基因农业动物一样瞄准抗病性和生产性能以外，还因其与人的生物学相似性，在器官移植、药物生产和特殊疾病模型等方面显示出特殊的价值。

转生长激素基因以提高生长速率的研究已有不少报道。转生长激素基因的猪，饲料转化率、增重率提高，脂肪减少。转Mx 1基因的猪抗流感病毒的能力增强。通过转基因方法解决器官移植中的超敏排斥反应的设想在转基因猪的研究中得到令人鼓舞的结果。这个实验将人的补体（一类参与免疫排斥的蛋白质）抑制因子h DAF基因导入猪的胚胎，得到在内皮细胞、血管平滑肌、鳞状上皮等不同组织的不同程度的表达，说明在供体组织中表达受体的补体抑制系统，克服补体介导的排斥反应是可行的。这个研究为异种器官移植展示了美好前景。转基因的家畜作为生物反应器生产新一代的药物已有许多例子，特别是乳腺作为生物反应器，产物已经进入市场。(www.xing528.com)

（二）分子标记技术与动物育种

进入20世纪80年代中后期以来，随着分子生物学、分子遗传学的迅速发展，以DNA分子标记为核心的各种分子生物技术不断出现，目前常用的分子标记已有10多种。例如，限制性片段长度多态性、DNA指纹（DNA finger print，DFR）、随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphi DNA，RAPD）、随机扩增微卫星多态性（random amplified microsatellite polymorphism，RAMP）、特异性扩增多态性（specific amplified polymorphism，SAP）、微卫星DNA（microsat ellite DN A）标记、小卫星DNA（minisatellite DNA）标记、扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）、单链构型多态性（single strand conformatiorl polvmorphism，SSCP）、线粒体DNA的限制性片段长度多态性（mitochond rial DNA rest riction fragment length polymorphism，mtDNA RFLP）、差异显示（differential display）法等。这些方法的应用，将大大促进动物分子育种工作的开展。

这些方法可用于以下几种情况。

（1）构建分子遗传图谱和基因定位。目前用DNA分子标记已经构建了一些动物的分子遗传图谱，这些图谱将为动物的进一步开发利用提供重要的基础资料。

（2）基因的监测、分离和克隆。主要经济性状相关的基因和一些有害基因的监测、分离和克隆。

（3）亲缘关系的分析。DNA分子标记所检测的动物基因组DNA差异稳定、真实、客观。可用于品种资源的调查、鉴定与保存，还可用于研究动物起源与进化、杂交亲本的选择和杂种优势的预测等。

（4）DNA标记辅助选种。利用DNA标记辅助选种是一个很诱人的领域，将给传统的育种研究带来革命性的变化，成为分子育种的一个重要方面。目前，许多研究都集中在各种DNA分子标记与主要经济性状之间的关系，从而寻找与经济性状相关的DNA标记作为选种指标，加快育种进展。

（5）性别鉴定与控制。一些DNA标记与性别有密切关系，有些DNA标记只在一个性别中存在。利用这一特点可以制备性别探针，进行性别鉴定。

（6）突变分析。由于大部分DNA分子标记符合孟德尔遗传规律，有关后代的DNA带谱可以追溯到双亲。后代中出现而双亲中没出现的带肯定来自于突变，进而可以推算动物在特定条件下的突变率。