人类对自然界的认识总是不断地经历由表及里、由浅入深的发展过程。面对五彩缤纷的大千世界，人们往往不满足于自然界的种种恩赐。历史上曾有不少有识之士提出过，在不同物种间进行杂交，以期获得具有双方优良性状的杂种生物的美好设想。然而常规的杂交育种由于物种间难以逾越的天然屏障而举步维艰。科学家们受细胞全能性理论及组织培养成功的启示，逐渐将眼光转向细胞融合，试图用这种崭新的手段冲破自然界的禁锢。1937年，Michel率先尝试植物细胞融合的实验。如何去除坚韧的细胞壁成了生物学工作者必须解决的首要难题。起初，科学家采用机械法切除细胞壁。他们先把植物外植体（或愈伤组织、悬浮培养细胞）进行糖或盐的高渗处理，引起脱水，细胞质收缩，最后导致质壁分离；随后用组织捣碎机等高速运转的刀具随机切割细胞，最终可能从中获得少量脱壁细胞（或亚细胞）供细胞融合用。不过经上述随机机械法制取的脱壁细胞往往活力低（损伤严重）、数量少，难以进行有效的实验操作。1960年，该领域终于出现了重大突破。由英国诺丁汉大学Cocking教授领导的小组率先利用真菌纤维素酶，成功地制备出了大量具有高度活性的、可再生的番茄幼根细胞原生质体，开辟了原生质体融合研究的新阶段。
植物细胞原生质体是指那些已去除全部细胞壁的细胞。这时细胞外仅由细胞膜包裹，呈圆形，要在高渗液中才能维持细胞的相对稳定。在酶解过程中残存少量细胞壁的原生质体称为原生质球或球状体。它们都是进行原生质体融合的好材料。
原生质体融合的一个有效方法是1973年Keller提出的高钙高pH法。第二年，加拿大籍华人高国楠首创聚乙二醇（PEG）法诱导原生质体融合，1977年，他又把聚乙二醇法与高钙高pH法结合，显著提高了原生质体的融合率。1978年，Melchers用此法获得了番茄与马铃薯细胞融合的杂种。1979年，Senda发明了以电激法提高原生质体融合率的新方法。由于这一系列方法的提出和建立，促使原生质体融合实验蓬勃开展起来。
（一）原生质体的制备
（1）取材与除菌。原则上植物任何部位的外植体都可成为制备原生质体的材料，但人们往往对活跃生长的器官和组织更感兴趣，因为由此制得的原生质体一般都生命力较强，再生与分生比例较高。常用的外植体包括种子根、子叶、下胚轴、胚细胞、花粉母细胞、悬浮培养细胞和嫩叶。
对外植体的除菌要因材而异。悬浮培养细胞一般无须除菌。对较脏的外植体往往要先用肥皂水清洗，再以清水洗2次或3次，然后浸入70%乙醇消毒后，再放进3%次氯酸钠处理。最后用无菌水漂洗数次，并用无菌滤纸吸干。
（2）酶解。由于植物细胞的细胞壁含纤维素、半纤维素、木质素及果胶质等成分，因此市售的纤维素酶实际上大多是含多种成分的复合酶，如纤维素酶、纤维素二糖酶及果胶酶等。此外，直接从蜗牛消化道提取的蜗牛酶也有相当好的降解植物细胞壁的功能。
现以叶片为例说明如何制备植物原生质体。①配制酶解反应液：配制pH为5.5～5.8的缓冲液，内含0.3%～3.0%的纤维素酶及渗透压稳定剂、细胞膜保护剂和表面活性剂等。②酶解：将除菌后的叶片撕去下表皮，切块放入反应液，不时轻摇，在25℃～30℃保温2～4 h，直至反应液转绿。③分离：可选取200～400目的不锈钢网或尼龙布进行过滤除渣，也可采用低速离心法或比重漂浮法直接获取原生质体。④洗涤：以新的渗透压稳定剂或原生质体培养液离心洗涤2～4次。⑤鉴定：在显微镜下观察植物细胞是否呈圆形。如果把它放入低渗溶液中，则很容易胀破。也可用荧光增白剂染色后置于荧光显微镜下观察，残留的细胞壁呈现明显荧光。通过以上观测，基本上可判别是否为原生质体及其百分率。此外，尚可借助台盼蓝活细胞染色、胞质环流观察及测定光合作用、呼吸作用等参数定量检测原生质体的活力。
（二）原生质体的融合
（1）化学法诱导融合。化学法诱导融合无须贵重仪器，试剂易于得到，因此一直是细胞融合的主要方法。尤其是聚乙二醇（PEG）结合高钙高pH诱导融合法已成为化学法诱导细胞融合的主流，简介如下。
在无菌条件下按比例混合双亲本原生质体→滴加PEG溶液，摇匀，静置→滴加高钙高pH溶液，摇匀，静置→滴加原生质体培养液洗涤数次→离心获得原生质体细胞团→筛选鉴定→再生杂合细胞。
通常，在PEG处理阶段，原生质体间只发生凝集现象。加入高钙高pH溶液稀释后，紧挨着的原生质体间才出现大量的细胞融合。其融合率可达10%～50%。这是一种非选择性的融合，既可发生于同种细胞之间，也可能在异种细胞间出现。有些融合是两个原生质体的融合，但也经常可见两个以上的原生质体聚合成团，不过此类融合往往不大可能成功。应当指出，高浓度的PEG结合高钙高pH溶液对原生质体具有一定毒性，因此诱导融合的时间要适中。处理时间过短，融合率降低；处理时间过长，则会因原生质体活力明显下降而导致融合失败。Jelodar介绍，以丙酸钙取代氯化钙作为助融合剂，细胞融合率和植板率（在固体培养基表面生长）都有明显提高，甚至超过了电激融合法。(www.xing528.com)
（2）物理法诱导融合。1979年，Senda等发明了微电极法诱导细胞融合。1981年，Zimmermann等提出了改进的平行电极法，现简介如下。
将双亲本原生质体以适当的溶液悬浮混合后，插入微电极，接通一定的交变电场。原生质体极化后顺着电场排列成紧密接触的珍珠串状。此时，瞬间施以适当强度的电脉冲，则使原生质体质膜被击穿而发生融合。电激融合不使用有毒害作用的试剂，作用条件比较温和，而且基本上是同步发生融合。只要条件摸索适当，也可获得较高的融合率。
上述操作实际上是供体与受体原生质体对等融合的方法。由于双方各具几万对基因，要筛选得到符合需要且能稳定传代的杂合细胞是相当困难的。最近，有人提出以紫外线、X射线、γ射线、纺锤体毒素或染色体浓缩剂等对供体原生质体进行前处理。小剂量处理可造成染色体不同程度的丢失、失活、断裂和损伤，融合后实现仅有少数染色体甚至是DNA片段的转移；致死量处理后融合则可能产生没有供体方染色体的细胞质杂种。利用这种所谓的不对称融合方法，大大提高了融合体的生存率和可利用率。
经过上述融合处理后再生的细胞株将可能出现以下几种类型。①亲本双方能融洽地合为一体，发育成为完全的杂合植株。这种例子不多。②融合细胞由一方细胞核与另一方细胞质构成，可能发育为核质异源的植株。亲缘关系越远的物种，某个亲本的染色体被丢失的现象就越严重。③融合细胞由双方细胞质及一方细胞核或再附加少量他方染色体或DNA片段构成。④原生质体融合后两个细胞核尚未融合时就过早地被新出现的细胞壁分开，以后它们各自分裂生长成嵌合植株。
（三）杂合体的鉴别与筛选
双亲本原生质体经融合处理后产生的杂合细胞，一般要经含有渗透压稳定剂的原生质体培养基培养（液体或固体），再生出细胞壁后转移到合适的培养基中。待长出愈伤组织后按常规方法诱导其长芽、生根、成苗。在此过程中可对是否为杂合细胞或植株进行鉴别与筛选。
（1）杂合细胞的显微镜鉴别。根据以下特征可以在显微镜下直接识别杂合细胞：若一方细胞大，另一方细胞小，则大、小细胞融合的就是杂合细胞；若一方细胞基本无色，另一方为绿色，则无色、绿色结合的细胞是杂合细胞；如果双方原生质体在特殊显微镜下或双方经不同染料着色后可见不同的特征，则可作为识别杂合细胞的标志。发现上述杂合细胞后可借助显微操作仪在显微镜下直接取出，移至再生培养基培养。
（2）遗传互补法筛选杂合细胞。显微鉴别法虽然比较可信，但实验者有时会受到仪器的限制，工作进度慢且未知其能否存活与生长。遗传互补法则可弥补以上不足。
（3）采用细胞与分子生物学的方法鉴别杂合体。经细胞融合后长出的愈伤组织或植株，可进行染色体核型分析、染色体显带分析、同工酶分析，以及更为精细的核酸分子杂交、限制性片段长度多态性（RFLP）和随机扩增多态性DNA（RAPD）分析，以确定其是否结合了双亲本的遗传物质。
（4）根据融合处理后再生长出的植株的形态特征进行鉴别。自从1960年Cocking取得制备植物原生质体的重大突破以来，科学家们在植物细胞融合，甚至植物细胞与动物细胞融合等方面进行了不懈的努力。最突出的成就当推番茄与马铃薯的细胞融合。已经获得的番茄-马铃薯杂交株，基本像马铃薯那样的蔓生，能开花，并长出2～11 cm的果实。成熟时果实黄色，具番茄气味，但高度不育。
综上所述，虽然细胞融合研究至今尚面临种种难题和挑战，但该领域在理论及实践两方面的重大意义，仍然吸引了不少科学家为之忘我奋斗，更为激动人心的研究成果一定会不断涌现出来。
免责声明：以上内容源自网络，版权归原作者所有，如有侵犯您的原创版权请告知，我们将尽快删除相关内容。
