转基因技术：应用、成果与挑战

将人工分离和修饰过的基因导入生物细胞的基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体性状稳定地整合、表达并可遗传地修饰，这一技术称为转基因技术。

随着分子生物技术的发展和相应遗传转化方法的建立和应用，人们对外源基因导入细胞的方法进行了大量探索，目前找到了适合在植物和动物细胞的DNA水平上的微观操作，解决了常规育种中存在的定向改良困难、育种范围窄、有益性状的识别和筛选困难并且耗时长等问题，打破了种间隔离，使基因能在种系很远的机体间流动，该技术将对整个生命科学产生全局影响，促进生物医学、农牧业和药物产业等多方面的发展。

1.动物转基因技术

（1）原核显微注射法：该方法是在转基因动物中应用最广、效果最好的方法，由美国Cordon所发明。将外源基因或体外构建的目的基因，在显微操作仪下用极细的微吸管吸取后，直接注射到处于原核期的受精卵原核中，再将注射后的受精卵体外培养数小时后移植到母畜体内，从其后代中获得转基因动物。通过该方法可以把较大片段的重组DNA注入原核，获得的转基因动物能有效地表达外源基因。但该法成本较高、转基因效率较低，只能在受精卵的原核期进行转基因操作，而且导入的外源基因为单位点、多拷贝整合，这样的整合方式容易导致外源基因首尾相连，给整合位点的克隆带来困难。

（2）反转录病毒载体法：该方法主要利用反转录病毒LRs（长末端重复序列）区域具有转录启动子活性这一特点，将外源基因插入反转录病毒的基因组中，病毒感染寄主细胞后，外源基因就被整合到受体基因组中。具体方法是在动物早期胚胎的培养液中加入载体病毒，或将胚胎与病毒细胞共培养，还可以把载体病毒注入囊胚腔中获得转基因动物。该方法是目前应用较成功的一种转基因方法，操作简单，能有效将目的基因以单拷贝形式插入宿主染色体内，基因表达效率较高，但该法产生的转基因动物多为嵌合体。

（3）体细胞核移植法：随着克隆技术的不断发展，利用携带外源基因的培养细胞进行核移植的方法逐步建立，先将外源基因插入体外培养的动物体细胞染色体的特定位点，然后筛选出阳性克隆，将阳性克隆移植到去除细胞核的卵细胞中，产生重构胚胎，再将重构胚胎移植到母体动物中，从其后代获得携带目的基因的个体。目前，通过该方法获得的转基因动物有绵羊、牛、猪和山羊等，产生个体的外缘基因整合率为100%，效率极高，但目前该技术还不成熟，很多技术细节还有待完善和提高。

（4）胚胎干细胞介导法：胚胎干细胞（ES细胞）是指囊胚期的内细胞团中尚未进行分化的细胞，这种细胞具有类似癌细胞的无限繁殖和高度分化的潜能，将目的基因转入ES细胞后再将其重新导入囊胚或对转入外源基因的ES细胞进行克隆，可培育出转基因个体。通过该方法，使外源基因的整合率较高，但产生的转基因动物均为嵌合体，不易建立ES细胞系，因此应用受到限制。(www.xing528.com)

（5）精子载体法：它是一种直接用精子作为外源DNA载体的基因转移方法，将精子直接与外源DNA混合培养，外源基因可以进入精子头部，精子与卵子结合后能直接发育成转基因动物，但外源基因的整合率较低。1989年，Lavitrano等首次报道用精子作为载体进行转基因获得了转基因小鼠。10年后，Anthony等改进了此方法，他先通过去垢剂、冻融或冻干等破坏小鼠精子的膜，使外源DNA可穿过外膜，吸附于内膜，接触到高密度的精子DNA，然后将精子注入MⅡ期的小鼠卵子中，获得表达外源基因的胚胎，再将桑椹胚或囊胚移至假孕母鼠的子宫内，从其后代群体中获得携带外源基因的小鼠。利用精子的自然属性，克服了人为机械操作给胚胎造成的损伤，整合率较高，成本较低，但转基因效果不稳定。

2.植物中常用的转基因技术

（1）农杆菌介导法：农杆菌介导法是目前应用最多且结果较为理想的一种基因转化方法。它利用根癌农杆菌和发根农杆菌为中间介体，让农杆菌感染受伤的植物细胞，然后将它所携带的质粒DNA片段整合到植物细胞基因组中，从而实现外源DNA到寄主植物细胞的转化。1977年，Chilton等发现植物细胞肿瘤组织中存在Ti质粒DNA片段，称为转移DNA，它能插入植物细胞中，后来人们发现发根农杆菌中Ri质粒也具有此功能，人们就利用转移DNA的这一特点，将其进行改造，然后将其导入受体细胞中，实现转化。但此方法应用的前提条件是受体植物的材料必须对农杆菌浸染敏感，故它主要应用于双子叶植物和少数单子叶植物的研究中。

（2）基因枪法：又称生物弹射击法。它是将外源基因或DNA在Ca2+或亚精胺等作用下吸附在重金属金或钨粒子表面，制成DNA微弹，利用基因枪将微弹高速射入植物受体细胞或组织中，从而实现转化。该方法最大的特点是不受植物种类限制，且可以直接轰击那些已完成形态分化的组织或器官，但它的不足之处在于，这一过程属机械和随机过程，受诸多物理因素（如金属弹大小、速度、均一性）的影响，整合效率不高，重复性差，对处理的植物材料也有一定程度的伤害。

（3）电击和聚乙二醇法：利用植物原生质体具有整合和表达外源DNA的能力，使细胞膜透性在电击或聚乙二醇处理下发生变化，出现一些可逆性孔隙，和原生质体膜直接接触的DNA分子可进入细胞，其中大部分DNA被细胞内酶降解，一小部分DNA整合到核基因组中，并可稳定遗传。质膜上可逆孔隙的大小、数量取决于电场强度、处理时间、溶液性质、细胞种类等。此方法优点是可以一次转化许多原生质体，但须具备原生质制备、培养和再生系统。

（4）花粉管通道法：利用植物授粉后，花粉在雌蕊柱头上萌发形成的花粉管通道，将外源DNA液用微量注射器注入花中，带入受精卵而自然发育成种子，观察其后代的变异，筛选出转基因植株。该方法最大的优点是不需经由组织再生，可直接从种子开始发育，省去一整套人工组培过程，而且所得到的转基因植株也排除镶嵌体的存在。此方法简单，大田、温室、盆栽均可进行，不受植物种类限制。但存在转化频率低、重复性不太高的缺点。