细胞融合技术的应用及方法

细胞融合（cell fusion），又称体细胞杂交（cell hybridization），即在自然条件下或用人工方法（生物、物理、化学），使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的过程。细胞融合技术不仅可在同种细胞间进行，也可进行种间细胞的融合，可以避开生殖细胞的受精过程，在亲缘更远的物种间实现基因转移，创造出自然界中没有的新物种，如番茄和马铃薯细胞融合创造出属间杂种薯番茄或番茄薯；甘蓝和白菜的细胞融合产生了甘蓝型油菜。细胞膜的流动性是细胞融合的生物学基础，环境因素如pH、极性基团、酶、离子强度、电场和脉冲等，均可对膜的流动性产生影响。对融合细胞施加物理、化学或生物的诱导因素，使细胞膜的脂类分子有序排列发生改变；当诱导解除后，细胞膜恢复原有的有序结构，在恢复过程中便可诱导相接触的细胞发生融合。细胞融合的方法有生物法、化学法、物理法和激光诱导法。各种方法均有不同的优缺点，利用PEG诱导细胞融合逐渐发展成为一种规范的重要化学融合方法，其优点是没有种间、属间、科间的特异性或专一性，实验成本低廉和融合率较高，大量应用于诸多实验中。融合诱导法是一种非常高效的细胞融合方法，融合频率是PEG的100倍，操作简便、快速，对细胞无毒，可在显微镜下观察融合过程，但是必须购置专用的细胞融合设备。利用激光微束可以对相邻细胞的接触区细胞进行破坏，从而诱导许多细胞中所需的两个相邻细胞融合，该方法最突出的优点在于它的高度选择性，定位性强，损伤小，参数易于控制。

细胞融合的主要步骤如下：选择两个有特殊价值并带有选择性遗传标记的细胞作为亲本，在高渗溶液中，根据不同细胞的特点，用适当的脱壁酶（动物细胞无细胞壁）去除细胞壁，获得原生质体。由于原生质体对溶液和培养基的渗透压非常敏感，必须在高渗透压或等渗透压的溶液或培养基中才能维持生存，在低渗透压溶液中将会破裂而死亡。两种不同的原生质体在高渗条件下混合，在助融剂聚乙二醇（PEG）和Ca2+作用下，发生细胞膜的结合，开始原生质体融合仅在接触部位的一小块区域，形成细小的原生质桥，继而逐渐变大导致两个原生质体融合。PEG是一种脱水剂，由于脱水作用，原生质体开始聚集收缩，相邻的原生质体融合的大部分面积紧密接触，Ca2+可提高融合频率。在融合时两亲本基因组由接触到交换，从而实现遗传重组，再生的细胞系中就有可能获得具有理想状态的融合细胞。在选择性培养基上，通过两个亲本的遗传标记互补而挑选出融合子。但是，由于原生质体融合后会产生两种情况，一种是真正的融合，即产生杂合二倍体或单倍重组体；另一种是暂时的融合，形成异核体。两者均可以在选择培养基上生长，一般前者较稳定，而后者不稳定，会分离成亲本类型，有的甚至可以异核状态移接几代。因此，要获得真正的融合子，必须在融合体再生后，进行几代自然分离、选择，才能筛选出真正的融合细胞。(www.xing528.com)

近年来，一些新的细胞融合技术逐渐出现，如基于微流控芯片的细胞融合技术，利用这种技术不仅可以实现对细胞甚至单个细胞的操控，如转移、定位、变形等，也可以同时输送、合并、分离和分选大量细胞，细胞融合在芯片上可以通过并行或快速排队的方式实现。此外由于在微通道内的腔体容积很小，因此会大幅减少细胞融合中所需的细胞数量，同时细胞融合率和杂合细胞的成活率会极大提高。利用微电极阵列产生的高强度、高梯度辐射电场，使得细胞在特殊辐射电场的作用下产生介电质电泳力，精确处理和刺激预定的目标细胞，从而使目标细胞按照预先设计的方向（可以是任何预先设计好的方向）以预定的速度（可以是不同种的细胞以不同的速度）定向移动，按照设计要求准确地、大批量地得到目标细胞配型，集成微电极阵列的微流控系统，可以方便灵活地实现对细胞的操作、隔离和转移，这种技术称为高通量细胞融合芯片技术。另外，高通量细胞融合芯片可以与化学诱导融合、电诱导融合等方法相互结合。例如，在细胞融合缓冲液中加入少量PEG可极大地提高细胞的融合率。此外，采用二价阳离子（如Ca2+）及蛋白酶对细胞进行预处理，融合率也可大幅提高。在利用动物细胞融合生产单克隆抗体过程中，由于无法排除地球引力的影响，要提高淋巴细胞和骨髓瘤细胞的融合得率相当困难。由于地球引力的存在，有液泡的原生质体与无液泡的原生质体的密度差加大，异源细胞间的融合得率十分有限。20世纪80年代以后，人们在空间材料科学的启发下，试图利用空间微重力条件改进细胞融合技术，即空间细胞融合技术。在微重力条件下，酵母细胞的融合得率有很大的增加，融合得率增加主要是由于降低了重力沉降影响，而杂种细胞的活力增加可能是由细胞排列时间缩短引起的。在取得这些成功实验的基础上，进一步研究融合后的细胞在空间培养的可能性已经具备。另外还有离子束细胞融合技术和非对称细胞融合技术，在此不再赘述。