发酵过程的工艺控制-生物技术与工程概论

1.发酵培养基

从微生物的营养要求来看，所有微生物的生长和发酵产物的积累都需要碳源、氮源、无机盐、微量元素、水和生长因子。培养基是微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的，按一定比例配制的多种营养物质的混合物。培养基的组成对菌体生长繁殖、产物的生物合成、产品的分离精制乃至产品的质量和产量都有重要的影响。微生物的营养活动是依靠向外界分泌大量的酶，将周围环境中大分子蛋白质、糖类、脂肪等营养物质分解成小分子化合物，借助细胞膜的渗透作用，吸收这些小分子营养物质来实现的。不同的微生物的生长情况不同或合成不同的发酵产物时所需的培养基有所不同，但发酵生产所用培养基的设计仍存在某些共同点可遵循，那就是所有的发酵培养基都必须提供微生物生长繁殖和产物合成所需的各种营养成分，对于大规模发酵生产，除考虑上述微生物的需要外，还必须重视培养基原料的价格和来源。生物体内各种生物化学反应必须在水溶液中进行，营养物质必须溶解于水中，才能透过细胞膜被生物利用。另外，有些产品的生产还需要使用诱导剂、前体和促进剂。

需要注意的是考虑碳源、氮源时，要注意快速利用的碳（氮）源和慢速利用的碳（氮源）的相互配合，发挥各自优势，避其所短。还要选用适当的碳氮比，碳氮比不当还会影响菌体按比例地吸收营养物质，从而直接影响菌体生长和产物的形成，菌体在不同生长阶段，对其碳氮比的最适要求也不一样。由于碳既作碳架又作能源，因此用量要比氮多。一般发酵工业中碳氮比为（100∶0.2）～（100∶2.0），但在氨基酸发酵中，因为产物中含有氮，所以碳氮比就相对高一些。如果碳源过多，则容易形成较低的pH；碳源不足，菌体衰老和自溶。氮源过多，则菌体繁殖旺盛，pH偏高，不利于代谢产物的积累；氮源不足，则菌体繁殖量少，从而影响产量。另外还要注意生理酸、碱性盐和pH缓冲剂的加入和搭配。根据该菌种生长和合成产物时pH的变化情况，以及最适pH所控制范围等，综合考虑选用什么生理酸、碱性物质及其用量，从而保证在整个发酵过程中pH都能维持在最佳状态。

2.温度对发酵的影响及其控制

温度影响各种酶的反应速率；改变菌体代谢产物的合成方向，影响微生物的代谢调控机制；影响发酵液的理化性质，进而影响发酵的动力学特性和产物的生物合成。因此，温度对菌体生长和代谢产物的形成都有影响。为保证发酵的正常进行，在发酵过程中必须控制最适的发酵温度。最适发酵温度是既适合菌体的生长，又适合代谢产物合成的温度。它随着菌种、培养基成分、培养条件和菌体生长阶段不同而改变。理论上，在整个发酵过程中不应只选择一个培养温度，而应根据发酵不同阶段，选择不同的培养温度。在生长阶段，应选择最适生长温度，在产物分泌阶段，应选择最适生产温度。例如，谷氨酸产生菌的最适生长温度为30℃～34℃，而生产谷氨酸的最适温度为34℃～36℃。因此，在种子培养阶段和谷氨酸发酵前期（0～12 h）长菌阶段，应满足菌体生长最适温度30℃～32℃（北京棒状杆菌As 1.299）或32℃～34℃（钝齿棒状杆菌Asl.542），有利于菌体利用营养物质合成蛋白质、核酸等供菌体繁殖之用。在发酵中期、后期（12 h以后）是谷氨酸大量积累阶段，菌体生长已基本停止，而谷氨酸脱氢酶的最适温度为32℃～34℃（Asl.299）或34℃～36℃（Asl.542），故发酵中、后期适当提高发酵温度对大量积累谷氨酸有利。

3.pH对发酵的影响及其控制

pH对菌体生长和代谢产物的形成都有很大影响：①影响酶的活性；②影响细胞膜所带电荷的状态；③改变细胞膜的通透性，影响微生物对营养物质的吸收和代谢产物的排泄；④影响营养物质的解离程度；⑤影响代谢途径及其产物。

培养基中营养物质的代谢是引起pH变化的重要原因，发酵液pH的变化是菌体代谢的综合结果。发酵pH随菌种的不同而各异，即使同一菌种，其生长最适pH也与产物合成的合适pH不同。例如，丙酮丁醇梭状芽孢杆菌发酵，在pH中性时，菌体生长良好，但产物产量很低，其实际发酵合适的pH为4～6。因此，在发酵过程中，要注意菌体生长与产物合成之间pH的相互关系，选择合适的pH。在了解发酵过程对合适pH的要求之后，就要采取各种方法加以控制。首先，考虑发酵培养基的基础配方，使各组分之间有适当的比例，以至于使发酵pH的变化处于适合的范围内，在分批发酵过程中，常在培养基中加入缓冲盐控制pH的变化。其次，可以直接补加酸类或碱类等物质以达到控制pH的目的。

4.溶解氧浓度的变化及其控制

溶解氧是好氧发酵控制最重要的参数之一。液体中的微生物只能利用溶解氧；而气液界面处的微生物除了利用溶解氧之外，还能利用气相中的氧。由于氧气在发酵液中的溶解度很小，仅为0.22mmol/L，因此，为了提高溶氧浓度，需要不断通风和搅拌，才能满足好氧微生物对溶解氧的需求。溶解氧的大小主要是由通风量和搅拌转速决定。溶解氧的多少还与发酵罐的径高比、液层厚度、搅拌器型号、搅拌叶直径大小、培养基黏度、发酵温度和罐压等有关。在实际生产中，搅拌转速固定不变，通常用调节通风量来改变通风比，控制供氧水平。溶解氧的多少对菌体生长和产物的形成及其产量都会产生不同的影响。

培养液中维持微生物呼吸和代谢所需的溶解氧必须与微生物的耗氧相平衡，这样才能满足微生物对氧的利用。在好氧发酵的培养液中维持微生物呼吸的最低氧浓度，称为临界溶解氧浓度。在发酵时需要考虑每一种发酵产物的临界溶解氧浓度和最适溶氧浓度，并使发酵液中的溶氧保持在最适溶氧浓度的范围内。最适溶解氧浓度的大小与菌体和产物合成代谢的特性有关，可由实验来确定。

5.菌体浓度与基质对发酵的影响及其控制

菌体浓度（cell concentration）简称菌浓，是指单位体积培养液中菌体的含量。菌浓的大小与菌体生长速率有很大关系。菌体生长速率与微生物的种类和遗传特性有关，不同种类微生物的生长速率各有差异。细胞越复杂，分裂所需时间就越长。

菌浓的大小对发酵产物的产率影响很大。在适当的比生长速率下，发酵产物的产率与菌体浓度成正比关系，即发酵产物的产率

P=Qmp·c（X）(www.xing528.com)

式中，Qmp为最大比生产速率；c（X）为菌体浓度。

菌浓越大，产物的产量也越大，但是，菌浓过高，营养物质消耗过快，会造成有毒代谢产物的积累，从而可能改变菌体的代谢途径，特别是使培养液中的溶解氧明显减少，并成为限制性因素。因为随着菌浓的增加，培养液的摄氧率（OUR）按比例增加，表观黏度也增加，流体性质也发生改变，使氧的传递速率（ORT）成对数地减少

ORT=QO2·c（X）

式中，QO2为氧消耗速率。当OUR大于ORT时，溶解氧就减少，并成为限制性因素。菌浓增加而引起的溶氧浓度下降，会对发酵产生各种影响。因此，为了获得最高产率，就要在发酵过程中设法控制最适的菌体浓度。在一定培养条件下，菌体生长速率主要受培养基基质浓度的影响。因此，在发酵生产中通过调节培养基的浓度控制菌浓。首先，确定基础培养基配方中各组分之间的适当配比，避免产生过浓或过稀的菌体量，然后通过中间补料来控制。其次，控制菌浓的方法还可以利用菌体代谢产生的CO2量来控制生产过程的补糖量。

基质是生产菌代谢的物质基础，它既涉及菌体的生长繁殖，又涉及代谢产物的形成，其种类和浓度与菌体生长代谢有密切关系。在分批发酵中，当基质过量时，菌体的生长速率与营养成分的浓度无关，但生长速率是基质浓度的函数，如Monod方程

式中，KS为饱和常数，其物理意义是生长速率一半时的底物浓度。

在S≪KS的情况下，比生长速率与基质浓度呈线性关系。在正常的情况下，可达到最大比生长速率，然而，由于代谢产物及其基质过浓，高浓度基质形成的高渗透压，引起细胞脱水而抑制多数微生物生长，因此导致菌体的比生长速率下降，此种效应称为基质的抑制作用。当葡萄糖浓度低于100～150 g/L，不出现抑制；当葡萄糖浓度高于350～00 g/L，多数微生物不能生长，细胞脱水。

6.CO2对发酵的影响及其控制

CO2是微生物的代谢产物，同时也是某些合成代谢的一种基质，它是细胞代谢的重要指标，对某些生产菌种的生长有刺激作用。但是，通常CO2对菌体生长具有抑制作用，使微生物对碳水化合物的代谢和呼吸速率下降。当排气中CO2的浓度高于4%时，微生物的糖代谢和呼吸速率下降。CO2除影响菌体生长、形态和产物合成外，还可能影响发酵液的酸碱平衡，使发酵液的pH下降，或与其他化学物质发生化学反应，或与生长必需金属离子形成碳酸盐沉淀，或氧的过分消耗引起溶解氧浓度下降等原因，这些因素均能间接地影响菌体生长和产物合成。由于CO2的溶解度比氧气大，因此随着发酵罐压力的增加，其含量比氧气增加得更快。因此，为了排除CO2的影响，必须考虑CO2在培养液中的溶解度、温度和通气情况。

CO2浓度的控制主要看它对发酵的影响。如果CO2对发酵有促进作用，则应该提高其浓度；反之，如CO2对产物合成有抑制作用，就应设法降低其浓度。通过提高通气量和搅拌速率，在调节溶解氧的同时，还可以调节CO2的浓度。此外，CO2的浓度也受发酵罐的罐压调节的影响。如果增大罐压，虽然溶解氧浓度增加了，但CO2的浓度也增加。而且CO2的溶解度比氧的溶解度大得多，因此在较高罐压下，不利于液相中CO2的排出，这对菌体代谢和其他参数也会产生影响。

7.泡沫对发酵的影响及其控制

在微生物好气发酵过程中，由于受通气和搅拌、微生物代谢及培养基的成分和理化性质等因素的影响，在通气条件下发酵液中产生许多泡沫，这是正常现象。产生泡沫是由于：①通气和搅拌作用；②微生物代谢的代谢和呼吸；③培养基中的起泡物质。当发酵感染杂菌和噬菌体时，泡沫异常增多。尽管泡沫是好氧发酵中的正常现象，但是泡沫过多会给发酵带来负面影响，如发酵罐的装料系数减少、氧传递系数减小等。若泡沫过多而不加以控制，导致大量“逃液”，造成经济损失，同时发酵液从排气管路或罐顶、轴封处逃出，使染菌机会增加，严重时使通气搅拌无法进行，泡沫中的代谢气体不易被带走，菌体呼吸受到阻碍，导致代谢异常或菌体提前自溶。菌体自溶会促使更多的泡沫形成。因此，控制泡沫是保证正常发酵的基本条件，工业上常采用机械消泡和化学消泡剂消泡或两种同时使用。

发酵工程的基本任务是高效地利用微生物所具有的内在生产能力，以较低的能耗和物耗最大限度地生产生物产品，因此必须对发酵过程实现有效的控制。发酵过程是通过各种参数的检测，对生产过程进行定性和定量的描述，以期达到对发酵过程进行有效控制的目的。微生物的生长代谢过程是动态变化过程，属于开放系统，即细胞是在不断地与外界环境进行各种物质交换。发酵参数可以正确地反映发酵条件和代谢的变化。特别是菌体生长代谢过程中pH的变化，它是菌体生长和代谢的综合表现。通过在线或离线检测，可对各种参数进行有效的控制。