微生物发酵过程检测：生物技术与工程概论

利用细胞或酶作为催化剂进行生物产品生产是发酵工程研究与开发的基本内容。不论采取哪种操作方式进行发酵，人们都需要对发酵的各种参数进行监控，如pH、温度、反应器中溶解氧浓度、菌种与培养基混合程度等，如果其中任何一个参数发生变化，都会引起细胞产量、目的产物生物合成量和稳定性发生巨大变化。只有通过各种参数（自动或手工）检测，对生产过程进行定性和定量的描述，进而实现对过程进行优化控制，才能使生产达到最佳状态。

（一）发酵过程检测

过程检测的参数是环境中的状态或操作量的变化值，通过进一步分析可得到反映细胞水平生命变化的信息。工业细胞培养操作多以分批操作形式进行，随着细胞生长和代谢过程的变化，各种测量参数随时间而变化，因而现代发酵过程有必要在计算机辅助下对过程进行综合检测或控制。

发酵过程参数可以通过传感器或其他检测系统以各种方式把非电量转换成电量变化，就能很方便地通过二次仪表显示、记录或传送到电子计算机处理或控制。

由于培养过程的纯种要求，培养前的高温灭菌处理和培养过程中的严密性，增加了参数检测的难度：主要表现在以下方面：①罐内插入的传感器必须能耐高热，而目前多数传感器难以耐受高温灭菌；②菌体以及其他固体物质附在传感器表面，导致一些传感器的使用功能受到影响；③罐内气泡影响带来对测量的干扰；④传感器结构必须防止杂菌进入和避免产生灭菌死角，因而使传感器结构复杂；⑤化学成分分析的电信号转换存在一定困难。

为了克服上述困难，人们在灭菌或取样方式上采取了一些补救方法和改进措施：①用化学试剂对传感器灭菌；②采用连续取样或罐外循环；③用微孔氟塑料管扩散导气法对培养液中的挥发性成分进行测量；④采用在线气相色谱（GC）、在线高效液相色谱（HPLC），甚至色-质谱联用等技术进行在线检测；⑤采用培养液连续透析法防止杂菌返回罐内等。

通过传感器或检测系统进行测量，可以分为就地信号系统和在线测量系统。就地信号系统对过程不会产生影响，例如pH、溶解氧浓度和罐压等测量。在线测量是利用连续的取样系统与有关的分析器连接，取得测量信号，其有效的响应时间应介于过程处理与控制的精度内。例如尾气取样的气体分析器、微孔氟塑料管扩散的培养液挥发成分分析系统、流动注射式分析器（FIA）、在线气相色谱、在线液相色谱、色-质谱联用技术等。离线测量是在一定时间内离散取样，在生物反应器外进行样品处理和分析的测量，包括常规的化学分析和自动的实验室分析仪系统等。比较和评价各种检测技术的主要性能指标有响应时间、转换系数、灵敏度、精度和稳定性等方面。

（二）发酵过程优化

发酵工程生产的主要问题在于控制不同的操作条件时，基本相同的投料量会得到完全不同的产量，有时会相差几十个百分点甚至数十倍，这就存在一个过程优化问题。发酵过程优化指的是在已经提供的常规菌种或基因工程菌的基础上，通过对生物反应器（发酵罐）操作条件的研究，或发酵设备的选型改造，达到发酵产品生产最优，即生产能力最大、成本消耗最低或产品质量最高。

温度是发酵成功的基本参数之一。微生物在低于最适温度时生长缓慢，细胞生产能力降低；如温度过高则又会导致细胞热休克（heat shock），细胞内产生大量蛋白酶，使目的蛋白产量降低。(www.xing528.com)

溶解氧浓度是发酵过程中的一个重要的条件。多数微生物最适生长条件都需要在培养基中溶解大量的氧气，由于氧气仅微溶于水（25℃时的溶解度为0.0084 g/L），因此必须以无菌空气的形式向培养基中通气才能满足微生物生长需要的氧气浓度。如果直接向反应器中通气会产生气泡，所以，生物反应器设计时必须考虑监测溶解氧水平、供氧以及使氧气有效混合和分散气泡的方法。

微生物细胞代谢过程中不断产生代谢产物并释放到培养基中，使反应器中pH发生变化。而绝大多数微生物在pH为5.5～8.5时生长最好，因此发酵过程中必须对培养基pH进行监测，并根据监测结果适量补充酸或碱以维持pH稳定。当然，补充的酸或碱要及时混合均匀，使得整个反应器中pH保持恒定。如果局部过酸或过碱则结果会适得其反。

充分混合同样是大规模发酵成功的一个重要条件，它能使细胞营养供应充分、防止有毒代谢产物局部积累。小规模发酵时很容易做到，但大规模发酵时则不太容易。这也是大规模发酵应该重视的问题。培养基的振荡混合还会对其他因素产生影响，如氧气从气泡向液体培养基、再向细胞内运输的速率，准确监测培养液中某种代谢物产量，有效热传导，使新加入的酸、碱、养料、消泡剂迅速扩散等。因此，适当的搅拌有利于微生物生长和产物合成。但过度搅拌会产生过大的剪切力，从而可能对微生物细胞或哺乳动物细胞、植物细胞产生破坏作用；此外，过度搅拌还会使体系温度升高、细胞活力降低。因此，要求人们在进行反应器设计时在有效混合与细胞破坏之间找到一个平衡点。

培养基成分是影响微生物生长和产物合成的重要因素。培养基必须包含微生物生长和产物合成的全部营养成分。培养基中的碳氮比值（C/N）是衡量一种培养基是否适用的重要指标之一，C/N不当不仅会造成不必要的浪费，而且可能会影响微生物的生长和产物的合成。通常情况下微生物生长最适营养成分与产物合成最适营养条件之间是不同的，因此种子培养基和发酵培养基之间也是有区别的。所以，不能把小规模培养用的培养基简单地搬到大规模发酵过程中。在选择发酵培养基时，还要考虑到是否有利于目标产物（如蛋白质、抗生素等）的分离以及培养基渗透压是否有利于微生物生长。

在发酵之前要对培养基进行灭菌处理，否则可能引入杂菌污染使整个发酵过程失败。在灭菌时最重要的是要找到既能杀死微生物，又不能严重破坏培养基营养成分的最适灭菌时间和灭菌温度。

在发酵培养基中，除了C、N、无机盐外，还需要加入生长因子或生长促进剂。生长因子包括维生素（主要是B族维生素）、嘌呤、嘧啶和氨基酸等物质，生长促进剂多为能提高酶活性、增加产物积累的物质。如果利用发酵生产的是提供人类食物或药物，则所有培养基中的成分包括使用的生长促进剂都要求不能对人体有害。

对于利用重组微生物进行大规模发酵还有其他方面的考虑。虽然绝大多数基因工程微生物是没有毒性的，但还是需要保证它们不会被无意中释放到环境中。因此，发酵时人们采用了故障自动停止系统，以防止重组微生物溢出。

实际工作中，为了实现实验室成果向工业规模的过渡，一般都需要经过中试规模的工艺优化研究。但是当放大到生产罐时，即使完全相同的操作条件，有时结果也会有很大差异。为了克服这些困难，特别是对一些规模较大的发酵罐，人们不得不采取逐级放大的办法，但依然没有从根本解决问题。这就是所谓发酵过程放大问题。发酵过程放大的研究已有很多理论与实践，但实际进展甚缓。有的单位引进了一些高产菌种，而实际生产时发酵单位达不到菌种所具有的能力，找不到原因时往往将其归纳为“水土不服”。因此，发酵过程优化与放大作为一个问题的两个方面，长期困扰着人们。随着科学技术的进步以及学科交叉发展，除了在原有技术基础上发展外，人们还不断引进了新的技术试图解决以上问题。