发酵操作方式及微生物生长动力学

微生物发酵操作方式可分为罐批发酵，补料分批发酵和连续发酵。分批发酵（batch）时，在灭菌培养基上接种相应的微生物，直至发酵结束不再添加新的培养基。补料分批发酵（fed-batch）是指在发酵过程中不同时期根据需要加入越来越多的营养物质，但不除去旧的培养基，直至发酵结束。连续发酵（continuous fermentation）则是在发酵过程中不断加入新的培养基，同时除去等体积的旧的含微生物的培养物。每一种发酵方式都需要氧气和消泡剂，氧气通常是以无菌空气的形式提供的；有些情况下还需要加入酸或碱以维持pH稳定。

（一）分批发酵

1.细胞生长动力学

在分批发酵过程中，细胞生长速度除了受到细胞本身生长特性影响外，还受到外部环境（如培养基组成、温度、pH、溶氧等）的影响。由于细胞生长状态、细胞代谢和营养物分解消耗等多种因素的影响，培养基组分、微生物密度、微生物细胞内部化学组成和目标代谢产物的含量都在不断变化。然而，在发酵生产过程中，细胞生长也有其规律性，只要掌握其生长规律，在工艺条件上加以控制，就可以根据需要使细胞生长速度维持在一定范围内，达到较好的生产效果。

在分批培养过程中，细胞生长一般要经历延迟期（lag）、加速期（acceleration）、对数生长期（logarithm）、减速期（deceleration）、稳定期（stationary）和衰亡期（death）6个阶段。

通常情况下，细胞接种到灭菌的培养基中以后，细胞数目并不会立即增长，这段时期称为延迟期。在延迟期内，细胞为了适应新的环境，例如不同的pH或新的营养物水平等，有可能会诱导出以前没有表达的代谢途径。如果用来接种的细胞是处于停止生长进入静止期的培养物，也会有延迟期，因为细胞进入静止期或是由于某种底物缺乏或产物抑制，细胞需要重新启动代谢系统以适应新的环境。如果接种的细胞处于对数生长期，则很可能不会有明显的延迟期。延迟期以后、对数生长期以前，细胞生长速度逐渐加快的时期称为加速期。在对数生长期，细胞数量会增长很多倍，但各种细胞特定的生长速率（specific growth rate）保持不变。当营养物（底物）成分过量，而产物抑制还没有发生时，细胞特定生长速率与营养物浓度无关。生物量的增长速率（dX/dt）是特定生长速率μ和生物量X的乘积，即

dX/dt=μX

当培养物中只有一种限制性基质，而不存在其他生长因素的限制时，那么μ为此限制性基质（碳源或氮源）浓度为S时，细胞的最大比生长速率μm和底物特异性常数Ks的函数如下。μm和Ks都是浓度单位，如g/L、mol/L等。

μ=μmS/（Ks+S）

当限制性基质的浓度S≫Ks时，μ=μm，这时的细胞比生长速率最大。当限制性基质的浓度S≪Ks时，增加基质浓度可明显提高细胞的比生长速率；当比生长速率达到最大比生长速率一半时，S=Ks。在实际情况中，Ks数值一般都很小，因此对数期很难遇到S≪Ks或S=Ks的情况。

有时，高浓度的基质也会对细胞的生长产生抑制，此时细胞的比生长速率可用下式表示：

在对数期末期，营养物质（底物）多数已经被消耗，浓度可能会降到Ks以下；当S≪Ks时，微生物生长很快进入减数期。因为对数生长末期培养基中的细胞数量很大，底物被迅速吸收利用，减数期可能很短，有时甚至观察不到。

减数期之后，由于某种关键性底物被耗尽，或者是一种或几种抑制性代谢产物的积累，培养体系中细胞增长逐渐停止，进入稳定期。在稳定期内虽然细胞数量保持一定，但细胞代谢方式常常会产生很大的变化，某些情况下可能合成有商业价值的次级代谢产物，如多数抗生素就是在这个时期合成的。稳定期时间的长短取决于微生物种类和培养条件。

在衰亡期内，细胞能量耗尽、代谢停止。对于绝大多数商业发酵过程来说，发酵在细胞进入衰亡期之前就已经停止了，收获细胞也是在衰亡期之前进行的。

分批发酵是传统的发酵方式，生产方式是间断进行的。每进行一次培养都要经过灭菌、装料、接种、发酵、放料等一系列过程，非生产时间长，生产成本高。

2.产物形成动力学

在分批发酵培养过程中，根据产物的产生与细胞生长之间的关系，可将产物的生物合成分为3种类型，即生长偶联型、非生长偶联型和半生长偶联型。

生长偶联型发酵产物的合成与细胞生长同步进行，又称同步合成型。当细胞进入生长期，产物即开始大量合成；当细胞生长进入稳定期后，产物的合成随着停止。

如利用根霉生产脂肪酶和树状黄杆菌生产葡萄糖异构酶，酶浓度与细胞生长随时间的变化呈平行关系，又如重组微生物发酵生产医用蛋白，目的蛋白产生与细胞生长成平行关系，其产物合成属于生长偶联型。生长偶联型发酵产物的生物合成可以诱导，但不受分解代谢物阻遏和反应产物阻遏。当除去诱导物或细胞进入稳定期后，产物的合成立即停止。这类产物所对应的mRNA是很不稳定的。生长偶联型中还存在一种特殊的形式，称为中期合成型，即产物的合成在细胞生长一段时间以后才开始，而在细胞进入稳定期后，产物的合成也随着停止。例如，枯草杆菌合成碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）受其反应产物无机磷酸的阻遏，而磷又是细胞生长必不可缺的营养物质；当细胞生长一定时间，培养基中的无机磷几乎被耗尽时（低于0.01μmol/m L），无机磷酸的阻遏解除，产物才开始大量生成。同时由于碱性磷酸酶所对应的mRNA不稳定，其寿命只有30 min左右，所以当细胞生长进入稳定期后，产物的合成也随着停止。该类产物生物合成的特点为合成受到反馈阻遏，而且其对应的mRNA也是不稳定的。

非生长偶联型发酵时，只有当细胞生长进入稳定期以后，产物才开始合成并大量积累，所以又称滞后合成型。许多水解酶类和大多数抗生素都属于这一类型。例如，黑曲霉产生的酸性蛋白酶（carboxyl proteinase）。非生长偶联型发酵产物对应的mRNA稳定性相当好。非生长偶联型的产物在对数生长期不合成的原因可能是由于受到分解代谢物阻遏作用的影响，当阻遏解除以后，产物才开始大量合成。(www.xing528.com)

半生长偶联型发酵时，产物的合成与细胞生长同步开始，在细胞生长进入稳定期后，产物还可以继续合成。例如黑曲霉细胞中聚半乳糖醛酸酶在乳糖醛酸诱导下的合成。再培养40h左右，细胞进入对数生长期，此时，酶开始合成，当培养至80 h左右，细胞进入稳定期，酶继续合成至120 h以后才停止。属于部分生长偶联型的产物可受诱导，但不受分解代谢物阻遏和产物阻遏，在进入稳定期以后相当长的一段时间内继续产物的合成。

在工业生产中，为了提高产物的生产效率，延长产物的发酵生产周期，产物最理想的生物合成模式应为半生长偶联型（延续合成型）。因为属于这一类型的产物，在发酵过程中没有明显的生长期和产物形成期之分。随着细胞生长开始即有产物的产生，直至细胞生长进入稳定期后，产物还可以继续生成一段较长的时间。对于其他合成类型的产物，要想提高产物的生产效率，延长产物的发酵生产周期，需要在细胞选育上下功夫，并在工艺条件方面加以适当的调节控制，使它们接近于半生长偶联型。

（二）补料分批发酵

补料分批发酵是一种介于分批培养和连续培养之同的培养方法，有时也称为半分批培养法。补料分批发酵细胞生长动力学和产物形成动力学与分批发酵基本相似，发酵过程中不同时间不断添加营养物质，使培养基的量逐渐增大，这样可以延长对数生长期和稳定期的时间，增加产物总积累量。因此，补料分批培养在发酵工业中有很广泛的应用。除生产大部分抗生素外，目前人们已经利用这种方法进行了一些细胞和蛋白质的生产。大多数抗生素是在稳定期产生的，抗生素生产发酵应尽可能延长稳定期维持时间，以利于产物积累。但是，稳定期微生物细胞常常会产生一些蛋白酶或蛋白水解酶，这些酶有可能降解重组微生物产生的任何一种外源性蛋白产物。所以在进行重组微生物发酵时，必须尽可能延长对数生长期、阻止发酵进入稳定期。

补料分批发酵过程中的一个重要问题是向反应器中加入什么物质以及何时加入这些物质。由于直接检测培养基浓度变化较为困难，人们通常采用与之相关的其他因素，如有机酸的产生、pH变化、CO2产生等指标来推断何时应该加入新的培养基。根据操作的不同，补料分批发酵可分为无反馈控制发酵和有反馈控制发酵。无反馈控制发酵补料分批发酵方式中，培养基的流量按预先设计好的条件进行添加。当流量一定时称为恒流操作。这种操作方式进行发酵时，理论上微生物的生长曲线是线性的。然而，微生物在每次发酵中的生长都有微妙的变化，无反馈控制发酵不能在操作具体过程中根据具体情况进行修正，应用范围不大。工业生产中通常都采用有反馈控制发酵，这种方式中添加的营养物质可以根据具体实际情况进行修正。

（三）连续发酵

在连续培养过程中，不断向反应器流加培养基，同时以相同流量从反应器中取出培养液。连续培养使用的反应器可以是搅拌罐反应器，也可以是管式反应器或其他类型的反应器。

进行连续培养之前，通常先要进行一段时间的分批培养，当反应器中的细胞浓度达到一定程度后，以恒定的流量向反应器中流加培养基，同时以相同流量取出培养液，使反应器内培养液的体积保持恒定。如果在生物反应器中进行充分的搅拌，则培养液中各处的组成相同，并且也与流出液的组成相同，成为一个连续流动搅拌罐反应器（CSTR）。对于各种物质，可按下式进行物料平衡：

流入速率=流出速率+反应消耗速率+产物积累速率

由于加入的培养基中不含细胞，因此：

其中，F——液体流量（m3/s）；

V——反应器内培养液体积（m3）；

——因细胞生长造成的细胞浓度变化率[kg/（m3·s）]；

——培养液中细胞浓度变化率[kg/（m3·s）]。

在连续发酵时，如果反应器中的细胞总数与总体积都保持不变，则体系就达到了稳态，即dX/dt=0。也就是说，取出的细胞与新生长的细胞数量上处于平衡状态。在一个连续稳态发酵过程中稀释率定义为流量与培养液体积之比，用D表示，既D=F/V。D与微生物特定生长速率相等。

连续培养进入稳定状态后，细胞的比生长速率与稀释率相同，这是单级连续培养的一个很重要的特性。进行分批培养时，细胞的比生长速率无法控制，而在连续培养时，则只要改变培养基的流加速率就可以改变稳态下细胞的比生长速率，这就有可能研究在一定比生长速率下的细胞特性。稀释率的大小是有一定的限制的，为了使连续培养物在流体力学上稳定，μ必须小于最大比生长速率μm。实际操作过程中，可以采用一个恒流泵来控制培养基流动速率F以达到反应器中培养物体积恒定的要求。

工业发酵的根本目的是以最低的成本获得最大的效益。为此就必须对每一个发酵的具体过程采取最有效的方式。与分批发酵相比，连续发酵成本要低很多，主要原因有：①连续发酵可以维持稳定的操作条件，细胞生理状态更加一致，产物产生的持续性更好，产品质量更高；②避免了大量设备清洗、准备、灭菌等非生产时间，提高了设备使用效率；③生产同样量的产物所用的生物反应器体积更小，并且细胞收获、裂解与下游纯化加工过程所需设备规模比分批发酵要小得多；④容易对发酵过程进行优化和实现生产过程自动化，有效提高发酵产率。

但是，连续发酵也存在一些不足：①连续发酵处于一个开放的状态，长时间维持工业规模的无菌状态非常困难；②连续发酵时间可持续500～1000 h，培养过程中一些工程细胞可能会丢失重组质粒，并且成为反应器中的优势菌群，造成反应器中产物合成细胞数量不断减少，从而使得反应器中产物产量逐步减少；③不同批次工业用的培养基成分质量可能会有所不同，这种质量差异会影响细胞最佳生理活性，降低产量；④对设备、控制仪表和调控单元器件要求很高。由于以上不足，连续发酵尚未在工业上普及应用，目前主要还是用于理论研究，如发酵动力学研究、过程优化等。

目前，研究人员已经研制出了实验室水平（小于、等于10 L）和中试水平（小于、等于1000 L）的连续发酵系统，用于重组微生物连续发酵生产蛋白质。有专家预测，连续发酵在工业上广泛应用可能只是一个时间问题，但短时间内还不能完全取代分批发酵。