《克隆基因的表达与DNA重组技术》，获得最大表达量的方法

DNA重组技术应用于生物技术领域的主要目的之一就是将克隆的目的基因在一个特定的宿主系统中表达，从而获得基因产物。如果是用于进行商业生产的话，通常希望目的基因有较高的表达水平。如果只是随意将基因插入某个载体中，并不意味着基因能够表达，更不能保证获得高水平表达。为了获得高水平的表达，科学家们还需要综合考虑控制转录、翻译、蛋白质稳定性和细胞外分泌等多种因素，设计出不同特点的表达载体来满足需要。具体而言，构建一个好的表达载体应考虑以下几方面的问题：①转录启动子和终止子序列的特点；②核糖体结合位点的强弱；③基因拷贝数和基因是存在于质粒还是整合到宿主染色体中；④合成外源蛋白在细胞中的定位；⑤宿主翻译效率；⑥表达蛋白在宿主细胞中的稳定性。由于大部分克隆的目的基因有其独特的分子特点、理化性质和应用要求，要获得最大表达量，就需要根据具体情况寻找出相应的表达载体与适当的宿主系统。作为表达载体的必要条件是：①很强的启动子，能为宿主细胞RNA聚合酶所识别；②很强的终止子，以使RNA聚合酶集中精力转录克隆基因，而不去转录其他无关的基因序列；③启动子必须是受控制的，只有当被诱导时才能进行转录。因为不受控制的转录不仅效率不高，而且给细胞造成不利影响；④所产生的mRNA必须具有翻译起始信号，既AUG和SD序列；⑤具备复制起点和可选择的酶切位点。

（一）外源基因在原核生物中表达

1.基因表达的调控元件

真核生物与原核生物基因的遗传密码是相同的，但真核细胞和原核细胞基因的表达调控存在很大差别，真核生物的cDNA必须接上原核生物的调控元件才能在原核细胞内表达。

启动子：基因的转录由启动子控制，选用强启动子可以使基因得到高水平的表达。通常基因工程中采用的强启动子都是可诱导的，以便待菌体适当生长后再诱导外源基因表达。目前，原核系统中使用较为普遍的强启动子主要有以下5个：①E.coli乳糖操纵子的启动子，该启动子经过紫外线诱变其活性不需要c AMP活化，但被调节基因lac I的阻遏蛋白所关闭，受异丙基巯代-β-D-半乳糖苷等诱导表达。②tac启动子，由trp启动子的-35区和lac启动子的-10区融合而成，受IPTG诱导表达，同时受lac阻遏蛋白调控。③λPL或λPR启动子，受入阻遏蛋白调节，其温度敏感突变株在30℃时启动子处于阻遏状态，温度升高超过40℃时阻遏蛋白失活，基因得到表达。④T7噬菌体启动子，可被T7RNA聚合酶特异识别并高效转录，常用来构建高效表达系统和体外转录系统。⑤E.coli色氨酸启动子，其调控主要由阻遏蛋白和衰减子完成。

核糖体结合位点：除了需要强启动子高效转录mRNA外，还需要有恰当的核糖体结合位点才能使mRNA高效翻译，目的基因才能得到高水平表达。在E.coli中，核糖体结合位点是在起始密码子（AUG）上游3～5个核苷酸处的一段富含嘌呤、长度为3～9个核苷酸的序列。该序列与16 S rRNA 3′端互补，因为该序列由Shine和Dalgarno发现，故称为SD序列。mRNA翻译效率受到SD序列与16 S rRNA 3′端互补程度的影响，还受到SD序列与起始密码子之间的距离、密码子上下游序列的影响。

终止信号：基因表达水平也受到转录终止信号（终止子）和翻译终止信号（密码子）的影响。在UAA、UAG、UGA三个密码子中，以UAA终止能力最强。

2.非融合蛋白与融合蛋白表达

非融合蛋白是指所表达的外源蛋白N端不含有任何其他氨基酸，因而要求翻译起点AUG必须位于要表达的外源基因5′端。将目的基因插入适合的启动子和SD序列下游，构成原核表达系统中的核糖体结合位点，就可以在原核生物中表达出非融合蛋白。要得到表达的非融合蛋白，要求SD序列与翻译起始位点AUG之间的距离要合适，两者之间的距离即使改变2～3个碱基，表达效率也会受到很大影响。非融合蛋白能很好地保持原来蛋白的活性，还可大大简化产品的后加工处理。但在表达过程中存在许多的困难，如容易被宿主细胞内蛋白酶降解而造成蛋白产量低等。为了改变这种情况，研究人员进行了许多实验，目前所采用过的方法主要包括以下两种：①选用黄嘌呤核苷（I）缺陷型菌株，这种菌株不能合成黄嘌呤核苷，从而不能合成蛋白酶，保护了表达的非融合蛋白；②利用细胞蛋白酶抑制剂抑制蛋白酶活性从而保护非融合蛋白。

外源蛋白通常在异源宿主细胞的含量很低，原因是多数情况下外源蛋白会被宿主细胞内蛋白酶降解。除了上述两种办法外，还可以将外源蛋白与一个宿主蛋白共价连接，构成融合蛋白，这样就可以保护基因表达产物不被宿主蛋白酶降解，提高目的蛋白产量。融合蛋白的构建是将两个蛋白基因的编码区连接，最简单的办法是将目的基因或其片段插入宿主基因的编码区。

然而，人们在某些情况下并不希望得到的终产物是融合蛋白，因为融合了宿主蛋白的产物使得大多数目标蛋白都不能适用于临床，有时还会影响其生理功能。因此，融合蛋白在分离后要切除其附加部分。比较常用的办法有：①在这两者之间插入可被蛋白酶识别的氨基酸序列，利用特异性蛋白酶水解融合部位肽键；②利用特异性化学试剂裂解肽键，如用溴化氰（CHBr）裂解蛋氨酸；③利用凝血因子Xa识别和裂解特定的序列（Ile-Glu-Gly-Arg）。

不论是真核细胞还是原核细胞，它们的分泌蛋白N端都有一段信号肽引导新合成的肽链穿过细胞膜，然后由信号肽酶将信号肽切除。利用这种机制，将外源蛋白与信号肽编码序列融合，表达的蛋白就可以分泌到细胞外，如细菌周质或培养基中，分泌过程中信号肽被切除产生有活性的蛋白质。

当外源蛋白在宿主细胞内高水平表达时，常常会产生不溶性包含体（inclusion body）。细胞经过破碎和离心可以得到包含体颗粒沉淀。包含体主要由不溶性外源蛋白和杂质组成，经过溶解变性和再折叠可获得有活性的蛋白质。溶解包含体常用的试剂主要有5～8 mol/L盐酸胍、6～8 mol/L尿素、SDS、碱性pH等。

3.大规模培养系统(www.xing528.com)

含有外源基因的细胞需要进行培养繁殖才能获得大量的目的蛋白。实验室小规模培养体系（通常为1～5 L）可采用直接改变培养环境温度或者向培养体系加入诱导物的方式诱导基因表达。但是在半工业化（20～200 L）和工业化生产的大反应器（＞200 L）中进行细胞培养时，升高温度既需要较长的时间，又需要大量的能量，加入化学诱导剂所需的量也很大，从经济上看是不合适的。为了解决这个问题，研究人员在使用带有λPL启动子的表达载体进行大规模发酵时，设计了“双质粒系统”。该系统的工作原理如下：用Trp启动子带动编码cI阻遏蛋白基因，然后将它们置于一个拷贝数较低的质粒中；将要表达的目的基因置于PL启动子的下游，使其表达受PL启动子调控。将这两个质粒同时转入宿主细胞，当培养基中没有色氨酸时，Trp启动子启动，合成cI阻遏蛋白，PL启动子带动的外源基因不能表达；如向培养基中加入色氨酸，Trp启动子关闭，没有cI阻遏蛋白合成，PL启动子带动的外源基因就可以表达。

采用这种双质粒系统，细菌可用非常便宜的含糖浆及酪蛋白水解物的培养基（只含少量的游离色氨酸）进行培养。在诱导表达时，向培养基中加入蛋白胨（其中含有足够的游离色氨酸）。研究结果表明，采用这一系统表达β-半乳糖苷酶、柠檬酸合成酶等多种蛋白基因，当加入蛋白胨诱导后，目标蛋白含量都非常之高。说明这一系统可以用于重组微生物大规模、经济地生产蛋白质。

（二）外源基因在真核生物的表达

在细菌中生产真核生物蛋白时，由于翻译后加工过程的缺陷，可能导致产物失去生物学活性。其主要原因是原核生物表达系统无法进行特定的翻译后修饰（形成正确的二硫键、切割前体、糖基化、氨基酸修饰等）；而且细菌中的有毒蛋白或有抗原性的蛋白可能会混杂在终产物当中。于是，研究人员构建了真核表达系统，用于生产药用蛋白。

真核表达系统与原核表达系统有类似之处，因而在载体构建上具有一些共同的要求，同时又有一些真核细胞特有的特点，主要包括：①选择标记和复制起点（多数真核表达载体都是穿梭载体，有两套复制起点和选择标记，一套在E.coli中作用，一套在真核宿主中作用）；②真核启动子；③转录、翻译、起始信号；④给mRNA加Poly（A）的信号；⑤染色体真核位点（如果载体要整合到染色体上，还需要一段与宿主染色体DNA有同源性的序列）。现在科学家们已经研制出了能在酵母、昆虫和哺乳动物等真核细胞中作用的穿梭载体。

1.酵母表达系统

酵母是单细胞真核生物，因其基因组小（1.4×107bp）、世代时间短（90 min，在小规模和大规模生物反应器中都能快速生长）、遗传背景清楚（约6000多个基因，编码5000个左右的蛋白，1/2已知）、安全，常用于真核生物基因结构和表达调节等方面的研究。同时，酵母菌即可以单倍体形式存在，也可以二倍体形式存在，因而避免了由于真核生物隐性基因的控制性状难以检测的缺陷。在基因工程中，酵母表达系统是应用最为广泛的表达系统之一，有真核生物大肠埃希菌之称。

酵母表达系统的载体可分为3类：质粒载体、整合载体（integrating vector）、人工染色体（YAC）。

酵母质粒载体又分为酵母附加型载体（yEp）、酵母复制型质粒（yRp）和酵母着丝粒质粒（yCp）。yEp来源于野生的酵母质粒，含有酵母可选择遗传标记和酵母2p质粒的复制起点，在酵母细胞内以高拷贝数存在。野生型质粒的一个重要特点是该质粒被一段长599 bp的反向重复序列分为两部分，每个部分都含有一个启动子和该启动子控制下的两个基因。其中一个基因称为FLP（编码一个位点特异性重组酶，该酶催化反向重复序列之间的遗传重组）。yEp就是在2p质粒基础上加入酵母核DNA序列和E.coli质粒p MB39的部分序列组成的。这样y Ep即可在酵母中复制，又可在E.coli中复制。yRp来源于pBR322，含有酵母菌染色体自主复制序列（ARS），以中等拷贝数存在。yRp一般不会与酵母菌染色体发生重组，转化酵母的转化效率很高，但不能稳定传代，这是该载体的一个严重缺点。为了克服yRp不能稳定传代的不足，研究人员构建了yCp。yCp含ARS和CEN，CEN在有丝分裂时与纺锤体结合，以单拷贝稳定存在。

整合载体含有酵母可选择遗传标记，但没有酵母菌自主复制序列，在酵母细胞内只有整合到染色体中才能稳定存在使其包含的基因得到稳定表达。

2.哺乳动物细胞表达系统

早期的哺乳动物细胞表达系统一般多用于研究基因功能与调控，因此很多载体都来源于动物病毒，如SV40、多瘤病毒、疱疹病毒、乳头瘤病毒等。由于这些载体宿主范围有限，只是瞬时表达、产物产率低，克隆步骤烦琐，某些病毒的DNA片段还有致癌可能，因而不能用来表达供人使用的药用蛋白或其他蛋白。同时，不少人体药用蛋白又必须在哺乳动物细胞中才能正确地修饰，所以研究人员致力于改进原有的载体和开发新型载体，以使哺乳动物细胞能成为新的生物反应器。

科学家们想了很多办法来克服早期载体的不足。办法之一就是将不同来源、控制各种有用特性的元件集中在一起构建复合穿梭载体，使之可以在特定细胞的特定条件下工作。