重组子筛选与鉴定方法

目的基因与载体DNA正确连接的效率、重组体导入细胞的效率都不是100%的，因此，最后生长繁殖出来的细胞并不都带有目的基因。一般一个载体只携带某一段外源DNA，一个细胞只接受一个重组DNA分子，培养出来的细胞群中只有一部分，甚至只有很小一部分是含有目的基因的重组体。将目的重组体筛选出来就等于获得了目的序列的克隆，所以筛选（screening）是基因克隆的重要步骤。在构建载体、选择宿主细胞、设计分子克隆方案时都必须仔细考虑筛选的问题，以方便从大量的培养细胞群中筛选出希望的克隆子。以下简要介绍几种常用的筛选技术。

（一）根据重组载体的标志进行筛选

1.抗药性筛选

最常见的载体携带的标志是抗药性标志，如抗氨苄青霉素、抗四环素、抗卡那霉素、抗氯霉素等。当培养基中含有抗生素时，只有携带相应抗药性基因载体的细胞才能生存繁殖，这就把未接受载体DNA的细胞全部筛除掉了。如果外源目的序列插入在载体的抗药性基因中间使抗药性基因失活，这个抗药性标志就会消失。

2.生化特性筛选

载体含有lac Z′的蓝-白筛选法近年更被广泛应用。例如，将目的序列插入质粒p UCl9的多克隆位点，转化E.coli，放入含氨苄青霉素、IPTG、X-gal的培养基中培养，凡能生长并呈白色的菌落，其细菌中就很可能含有插入目的序列的重组质粒，这样就很容易获得目的序列的克隆。

根据重组载体的标志来筛选，可以筛选去除大量的非目的重组体，但还只是粗筛，例如细菌可能发生变异而引起抗药性的改变，却并不代表目的序列的插入，所以需要做进一步的筛选。

（二）核酸杂交法筛选

利用标记的核酸作为探针与转化细胞的DNA进行分子杂交，可以直接筛选和鉴定目的序列克隆。常用的方法是将转化后生长的菌落影印到硝酸纤维膜上，用碱裂解细菌，菌落释放的DNA就吸附在膜上，再与标记的核酸探针温育杂交，核酸探针就结合在含有目的序列的菌落DNA上而不被洗脱。核酸探针可以用放射性核素标记，结合了放射性核酸探针的菌落集团可用放射性自显影（autoradiography）法指示出来。也可以用非放射性物质（如生物素）标记，经颜色呈现指示位置，这样就可以将含有目的序列的菌落挑选出来。

（三）PCR法(www.xing528.com)

PCR技术的出现给克隆的筛选增加了一个新手段。如果已知目的序列的长度和两端的序列，则可以设计合成一对引物，以转化细胞所得的DNA为模板进行扩增，若能得到预期长度的PCR产物，则该转化细胞就可能含有目的序列。

（四）免疫学方法和酶活性检测法

免疫学方法就是利用特定抗体与目的基因表达产物特异性结合作用来进行筛选。此法不是直接筛选目的基因，而是通过与基因表达产物的反应来指示含有目的基因的转化细胞，因而实验设计要使目的基因进入宿主细胞后能表达出其编码产物。抗体可用特定的酶标记（常用过氧化物酶、碱性磷酸酶），在结合酶标抗体处，酶可催化特定的底物分解而呈现颜色，从而指示出含有目的基因的细胞集落位置。免疫学方法特异性强、灵敏度高，适用于从大量转化细胞集合体中筛选少数几个含有目的基因的细胞克隆。

如果目的基因编码产物是一种酶，或酶的激活剂/抑制剂，可通过酶促反应来检测。酶促反应如果是显色反应，甚至可以不必转接克隆，直接在平板上显色就能筛选。如果产物是配体，可通过与受体的结合来筛选。

（五）DNA限制性内切酶图谱分析

目的序列插入载体会使载体DNA限制性酶图谱发生变化。例如，一个长600 bp的目的序列利用它两端的Eco RI或Sal I酶切后的黏性末端连接插入p UCl 9的多克隆位点，则重组质粒就会增大3.3 kb，用Eco RI或Sal I双酶切后会出现600 bp和2.7 kb两个DNA片段，提取转化细菌的质粒DNA做酶切后，再电泳观察其酶切图谱，就能分析得到结果；如插入的目的序列中有其他限制性内切酶位点，也能在酶切电泳图谱上观察到。这就可以进一步鉴定重组体是不是所要的目的克隆。

（六）核苷酸序列测定

所得到的目的序列或基因的克隆，都要做核酸序列测定来最后鉴定。已知序列的核酸克隆要经序列测定确证所获得的克隆准确无误；未知序列的核酸克隆要测定序列才能确知其结构、推测其功能，并进一步研究。因此，核酸序列测定是分子克隆中必不可少的鉴定步骤。