生物技术概论：目的基因的来源与获取

基因工程设计和基因操作中，首先要获得目的基因。所谓目的基因是指被用于基因重组、改变受体细胞性状或获得预期目标产物的基因。目的基因可能是一个基因的编码区，或包含启动子、终止子的功能基因；可能是一个完整的操纵子，或由几个功能基因、几个操纵子结合在一起的基因簇。不同基因的大小和组成各不相同，获得目的基因的方法也有很多种。如果基因序列是已知的，可以通过化学合成或用PCR由模板扩增；对最为常用并且不需要已知序列的基因，可以构建一个基因文库或cDNA文库，从中筛选分离目的基因。由于每种基因，特别是单拷贝基因占整个生物基因组很少部分，且DNA的化学结构相似，具有相似的理化性质，给分离特定的目的基因带来很大困难。尽管如此，人们仍可以通过多种方法有效地从各种生物体中分离出所需要的基因。

（一）基因组文库的建立和基因的分离

基因组文库（genomic DNA library）是指将整套基因组DNA通过限制性内切酶进行部分酶解，所产生的基因组DNA片段随机地与相应的载体重组、克隆的总和。

在很多情况下，基因工程的目的是分离某一编码蛋白的基因。原核生物的结构基因通常会在基因组DNA上形成一个连续的编码区，但真核生物中外显子常常被内含子隔开。因此，对原核生物和真核生物基因的分离要分别采用不同的克隆步骤。

在原核生物中，目的基因通常在染色体总DNA中的含量非常少（小于0.02%），其基因文库构建的基本过程大致如下：首先用限制性内切酶对总DNA进行酶解，然后将这些酶解DNA片段克隆到载体，再对带有外源DNA片段的重组克隆进行鉴定（如限制酶切、DNA杂交、PCR或其他方法）、分离、再培养（扩增）和进一步鉴定。

构建得到的基因文库应测定其库容量（库中包含的克隆数）。在理想情况下，所产生的克隆群体应包含该基因组全部的遗传信息。究竟基因组文库应包含多少DNA克隆才能使任意所需要的基因以极高的概率存在于该库中？用以下公式进行计算，可大致估计各步操作应达到的数量。

N=ln（1-p）/ln（1-f）

式中，N为文库中所包含克隆的数目；p为任意所需基因存在于该库中的概率，通常要求大于99%；f为克隆的DNA片段大小（bp）占基因组大小（bp）的分数。

一个基因文库可以多次使用，从中筛选出各种克隆的基因。如果需要，可以适当地对文库加以扩增。但是扩增基因文库时并不是所有克隆成员都是等速增殖的，插入外源DNA的大小和序列差异可能会影响到重组体的复制速度。因此，当基因文库被扩增后，某些重组体数目的比例可能会有所增加，某些重组体可能会减少甚至丢失。由于新的载体和克隆技术的发展，构建基因文库已经大为简化，一些研究人员宁可在每次筛选基因时重新构建，也不愿意使用经过储存和扩增的基因文库。

基因组DNA文库有着非常广泛的用途，如用于分析、分离特定的基因片段；通过染色体步查（chromasome walking）研究基因的结构；用于基因表达、调控的研究；用于人类及动、植物基因组学研究等。

（二）cDNA文库的建立与基因的分离

上述方法同样适用于真核生物。但真核生物基因结构和调控元件与原核生物有很大的不同，从真核基因组DNA文库所分离得到的基因序列包含有内含子序列，不能直接在原核细胞中进行表达。对于真核生物，cDNA的克隆对于特定基因的分离和特性研究更具实际价值。所谓cDNA文库是指细胞全部mRNA逆转录成cDNA并被克隆的总和。cDNA文库关键的特征是它只包括在特定组织或细胞类型中已经被转录成mRNA的那些基因序列，因此cDNA文库的复杂性要比基因组文库低得多。由于不同的细胞类型、发育阶段以及细胞所处的特定状态是由特定基因的表达所决定的，所以各自的mRNA的种类就不同，由此产生出独特的cDNA文库。在建立cDNA文库时，如果选择的细胞或组织类型得当，就比较容易从cDNA文库中筛选出所需要的基因序列。

组建一个cDNA文库的步骤如下。

（1）分离表达目的基因的组织或细胞。构建高质量的cDNA文库关键在于获得高质量的mRNA。为了最大限度地得到目的基因mRNA和全长的cDNA，要尽量避免其他组织或细胞基因的混杂污染，所用的材料要尽量新鲜，以尽可能避免无处不在的RNA酶对mRNA的降解。

（2）从组织和细胞中制备总体RNA或mRNA。从有限量的起始材料去组建cDNA文库时需要保证有足够量的mRNA用于第一条互补链DNA的合成。

（3）cDNA第一链的合成。第一条互补DNA的合成需要RNA模板、cDNA合成引物、逆转录酶、四种脱氧核糖核苷三磷酸（d NTP）以及相应的缓冲液（Mg2+）等。RNA模板可以用总RNA或poly A-mRNA。第一条链的合成质量可用碱性琼脂糖凝胶电泳来检测。

（4）cDNA第二条链的合成。目前，常用的cDNA第二条链的合成方法有置换合成法、引物-衔接头合成法等。置换合成法：特点是作为第一条链合成反应产物的cDNA-mRNA杂交分子充当切口平移的模板；Rnase H在杂交分子上的mRNA链上造成切口或缺口，产生一系列RNA引物，它们被E.coli的DNA聚合酶Ⅰ用以合成第二条链。该法的优点是效率高，直接利用第一条链反应产物，无须进一步处理和纯化，改善了cDNA的质量。引物-衔接头法：特点是通过将cDNA两端加上限制性内切酶位点，使其较方便地克隆到相应的载体。

（5）cDNA的甲基化和接头的加入。一旦双链cDNA被合成，可以用标准方法将cDNA甲基化和在其5′和3′端加上适当的接头。接头除了提供相容的末端以便将cDNA进行克隆外，也可以作为双链cDNA PCR扩增引物位点。(www.xing528.com)

（6）双链cDNA与载体的重组。双链cDNA同载体的有效连接也是建立cDNA文库的关键，特别是起始材料很少时更是如此。为保证cDNA文库具代表性，要选择尽可能有效的载体。通常用Xgtl 0、Agtl l及与其相当的载体来构建非表达和表达的cDNA文库。

cDNA文库的建立为分离真核细胞中特定的有用基因提供了来源，也为研究特定细胞中基因表达的相对水平开辟了道路。如果分离cDNA克隆的目的只是为分离少数几个基因，cDNA文库数量上的代表性就不必太多考虑，但必须正确选择所用的细胞类型。

（三）直接从特定的mRNA分离基因

如果在细胞中特定mRNA含量非常高，如哺乳动物网织红细胞中珠蛋白mRNA的比例占总RNA量的90%以上，则可以通过mRNA→cDNA→dscDNA的途径直接得到基因。

（四）从蛋白质入手分离编码蛋白的基因

如果手中有足够量可产生抗体的来源于真核细胞的蛋白质，可以通过双抗体免疫法分离出此蛋白质的基因。基本原理如下：核糖体沿mRNA进行多肽链合成时形成多聚核糖核蛋白体，具有不同长度的新生肽链在核糖体上不断延伸。将从细胞匀浆液中制备出的多聚核糖核蛋白体同特定抗体一起保温，形成多聚核糖体与抗体的复合体，但这种复合体不足以从细胞总多聚核蛋白体中沉淀出来。当加入由此特定蛋白的抗体产生的第二抗体时，就可以通过不连续蔗糖梯度离心，将所要的含有特定mRNA的多聚核糖体同总多聚核糖体分离，用酚、氯仿抽提去除蛋白，再经oligo-d T柱亲和层析分离，就可以得到为特定蛋白编码的mRNA；然后通过逆转录得到cDNA。从理论上讲，用此方法可以将只占真核总RNA 0.1%的mRNA分离出来。由于发现金黄色葡萄球菌中的protein A可以同IgG产生免疫反应而代替第二抗体，所以发展出用protein A-Sepharose 4B作为亲和层析介质，通过亲和层析的方法分离特定的多聚核糖体。

（五）基因的化学合成

随着寡核苷酸化学合成的自动化，基因的化学合成变得更经济、容易和准确。化学合成基因对那些用其他技术方法不容易分离的基因尤为重要。基因合成的方法可大致分为以下两种。

1.基因片段的全化学合成

首先合成组成一个基因的所有片段，相邻的片段之间有4～6个碱基的重叠互补，在适当的条件下（主要是温度条件）经退火后，用T4DNA连接酶将各片段连接起来形成一个完整的基因。化学合成的DNA片段在纯化后其5′端及3′端都为羟基，所以在组建基因之前要将DNA片段的5′端磷酸化。对于较大的基因，一般将基因分成几个亚单位进行分子克隆，然后分离纯化这些亚单位，再重组成一个完整的基因，最后克隆到适当的表达载体进行表达。

2.基因的化学-酶促合成

此法的特点是不需要合成组成完整基因的所有寡核苷酸片段，而是合成其中一些片段，相邻的3′端有一短的序列互补，在适当的条件下通过退火形成模板-引物复合体，然后在存在四种d NTP的条件下，用DNA聚合酶Ⅰ大片段去填补互补片段之间的缺口，最后用T4 DNA连接酶及适当的限制性内切酶切割后重组入载体。对于较短的多肽基因，可以将上述方法进行修改，通过化学合成与PCR方法相结合得到所需要的基因。

（六）利用PCR或RT-PCR分离基因

PCR技术的出现使基因的分离和改造变得简便得多，特别是对原核基因的分离，只要知道基因的核苷酸序列，就可以设计适当的引物从染色体DNA上将需要的基因扩增出来。反转-PCR（RT-PCR）使得人们可以从mRNA入手，通过逆转录得到cDNA，在适当的引物存在下，通过PCR扩增基因。

（七）利用基因定点诱变获得新基因

基因定点诱变是基因工程的一项重要技术，借助这一技术才使得基因定向改造和有效表达成为可能。基因定点诱变（site-directed mutagenesis）是指按照设计要求，使基因特定序列发生插入、删除、置换和重组等变异。基因定点诱变的方法很多，有的是改变特定核苷酸，有的是对一段最有可能影响蛋白质功能的基因序列进行随机突变，产生一系列突变蛋白。目前常用的方法主要有在酶切位点处插入、删除和置换序列，用寡聚核苷酸指导的诱变和PCR诱变等。