基因克隆载体和宿主系统在《生物技术与工程概论》中的应用

（一）基因克隆载体

借助限制性内切酶可以切出含有目的基因序列的DNA片段，但被分离或改造的目的基因核酸序列本身不能进入宿主细胞，也不能进行复制。因此，还需要一种DNA分子将目的基因导入细胞并进行复制。这种将外源DNA带入宿主细胞并进行复制的运载工具称载体（vector）。根据功能的不同，又可分为克隆载体和表达载体。以繁殖DNA片段为目的的载体称为克隆载体（cloning vector），克隆载体一般较小，在细胞内拷贝数也很高，含有在宿主细胞内复制的起始位点。表达载体（expression vector）是用来将克隆到的外源性基因在宿主细胞内表达成蛋白质的载体，除有复制起点外，还含有可调控的启动子、终止子。

现在已经构建和应用的载体有很多种，它们分别由从细菌质粒、噬菌体DNA、病毒DNA分离出来的元件或染色体DNA经过改造组装而成。细菌和真菌的克隆载体一般由质粒来构建，对有特殊要求的可采用噬菌体构建。动、植物基因载体多用病毒或染色体DNA构建。

作为克隆载体的最基本要求是如下。①具有自我复制能力，并能带动插入的外源基因一起复制。②具有合适的限制性内切酶位点。通常载体上单一的限制性酶切位点越多越好，这样可以将不同限制性酶切割后的外源基因片段方便地插入载体，插入后不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制。③具有合适的筛选标记基因，如抗药性基因、营养缺陷基因等，容易从宿主细胞中分离纯化出来，便于重组操作。④在细胞内拷贝数要多，这样才能随时使外源基因得以大量扩增。⑤载体的相对分子质量要小，可以容纳较大的外源DNA插入片段。如载体的相对分子质量太大，将影响重组体或载体本身的转化率。⑥在细胞内稳定性高，可以保证重组体稳定传代而不易丢失。⑦载体必须安全，不应含有对宿主细胞有害的基因，并且不会转入除宿主细胞以外的其他生物细胞，特别是人的细胞。此外，根据不同的目的还有各种各样的特殊要求。如基因工程工作中为了便于操作，人们通常先在E.coll中扩增目的基因，然后将目的基因与载体构成适当的重组体再转入真核细胞。那些既含有原核细胞复制起点，又含有真核细胞复制起点，能带动插入DNA序列在不同种类真核或原核宿主细胞中存在和复制的载体称穿梭载体（shuttle vector）。用于真核细胞的载体常构建成穿梭载体。(www.xing528.com)

（二）基因克隆/表达的宿主系统

克隆/表达载体需要在适当的宿主细胞内才能发挥其功能，细菌、真菌、动/植物细胞都可作为宿主细胞。用于基因克隆/表达的宿主细胞通常应满足以下要求：①易于接受外源DNA，为感受态细胞（competent cell）；②宿主细胞必须无限制性酶；③宿主细胞无重组能力（rec A-）；④宿主细胞易于生长和筛选，克隆/表达载体的标志必须与之相配，如载体带有a-肽基因lac Z′，其宿主细胞的β-半乳糖苷酶基因必须是突变体lac Z△M15；⑤符合安全标准，如基因工程菌必须依赖人工培养基，在自然界不能独立生存等。对某些有害基因，其宿主细胞安全性要求更高。