生物技术工程实用工具

要进行DNA分子重组，目的DNA和克隆载体都需要经过切割变成连续的、可再生的片段，并且要求将不同来源的DNA分子再次拼接起来。如果希望在E.coli等原核生物细胞中表达真核细胞产物，还需要先将真核mRNA反转录成为双链互补DNA（cDNA）……这些工作都要有不同的工具酶来催化完成。

（一）DNA限制性内切酶和甲基化酶

DNA限制性内切酶（restriction endonuclease）是一类能识别双链DNA中的特殊核苷酸序列，并在适当的反应条件下使每条链特定位点上的磷酸二酯键断裂，产生具有3′—OH或5′—P突出的黏性末端，或平末端DNA片段的内切脱氧核糖核酸酶（endodeoxyribonuclease）。至今已经发现的DNA限制性内切酶可分为3大类，Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型酶，生物活性各具特点。Ⅰ型酶是多亚基双功能酶，对DNA甲基化和切割由同一个酶来完成。该酶有3种亚基，S亚基为识别亚基，可结合于特定的识别位点；M亚基具有甲基化酶活性；R亚基具有限制性内切酶活性，可在远离识别位点至少1 kb以上处随机切割。由于切割是随机的，因而很难形成稳定的、特异性切割末端。这类酶在基因工程中并无实际用途。Ⅲ型酶是两个亚基的双功能酶，M亚基负责识别与修饰，R亚基负责在识别位点下游24～26 bp处切割DNA。这类酶在基因工程中也基本不用Ⅱ型限制性内切酶是基因工程中所用的主要工具酶，如果没有专门的说明，通常所说的限制性内切酶就是指Ⅱ型DNA限制性内切酶。Eco RI是最早发现的一种Ⅱ型限制性内切酶，它是从大肠埃希菌中分离鉴定出来的。Eco RI特异性地结合在一段6个核苷酸的序列DNA区域，在每一条链G和A之间切断DNA。DNA经Eco RI对称切割后产生两个单链末端，每个末端有4个核苷酸延伸出来，称为黏性末端。

多数限制性内切酶具有以下特点。

（1）识别并切割的序列是一种回文序列（palindrome series）的DNA，又称为识别序列或识别位点。识别位点的长度一般为4、5、6或8个核苷酸（少数酶能识别更长的序列或简并序列）。由于限制性内切酶识别位点在DNA中出现的频率不同，识别位点序列短的限制性内切酶会更加频繁地切割DNA分子。因此，实验室中较为普遍使用的限制性内切酶是识别4个或6个碱基对的酶。

（2）具有特定的酶切位点，即限制性内切酶在其识别序列的特定位点对双链DNA进行切割，由此产生出特定的酶切末端。双链DNA被酶切后可出现两种形式的末端：一种是黏性末端，既在切割后产生3′—OH突出的末端或5′—P突出的末端DNA分子；另一种是两端平整的末端DNA分子。

（3）限制-修饰系统是由两种酶分子组成的二元系统。一种为限制性内切酶，另一种为独立的甲基化酶，修饰与限制性内切酶位点相重叠的序列，以减少酶的切割频次。

（4）不同来源，但识别同样顺序和相同切割位点的限制性内切酶，称同裂酶（isoschizorner）。有时两种限制性内切酶识别不同的核苷酸序列，但切割后DNA分子所产生的黏性末端相同，称同尾酶（isocaudamer），如MboI、BclI、Sau 3A、Xho II、Bgl II就属于一组这类酶，它们的识别序列虽不同，但都产生相同的5′黏性末端。由同尾酶切割的限制片段彼此相连后不能被原来的限制性内切酶切割，这类酶为具不同酶切位点的DNA片段的重组提供了极大的方便。

科学家们已经从不同的细菌中分离出了几百种限制性内切酶。限制性内切酶在基因工程中的主要用途是通过切割DNA分子，对含有特定基因的片段进行分离、分析。目前，基因工程中所用的几乎所有限制性内切酶都已有商品化制剂出售。

甲基化酶已用于很多的基因工程操作中。就许多限制性内切酶而言，也已分离到与其相对应的甲基化酶。这些甲基化酶可以通过甲基化作用修饰限制性内切酶识别序列，使之不受相应的限制酶切割。在构建基因组DNA文库或eDNA文库时，利用甲基化酶使存在于DNA片段内的一些限制内切酶识别序列甲基化，避免了这些片段在基因工程操作时被相应的限制内切酶切碎，便于较大DNA片段有效克隆。

（二）DNA连接酶

用于将两段乃至数段DNA片段拼接起来的酶，称为DNA连接酶（DNA ligase）。要将目的基因与载体连接形成重组DNA分子，DNA连接酶是必不可少的。基因工程中最常用的连接酶是T4DNA连接酶，它催化DNA 5′—P与3′—OH之间形成磷酸二酯键，即可以连接黏性末端，也可以连接平末端。

除T4DNA连接酶外，还有E.coli DNA连接酶，它催化的反应基本与T4DNA连接酶相同，但只能连接黏性末端，催化反应需要DNA+参与提供能量。另一种T7DNA连接酶，催化单链DNA或RNA的5′—P与另一单链DNA或RNA的3′—OH之间形成共价连接。(www.xing528.com)

（三）碱性磷酸酶

DNA片段两端若为相容性黏性末端或平末端，连接时可以发生分子间串联或分子自身环化。此时何者占优势取决于DNA片段的长度与浓度，DNA链长度较短、浓度较低，有利于自身环化；反之，则有利于分子间串联。

（四）DNA聚合酶与平末端脱氧核苷酸转移酶

DNA聚合酶在基因工程中的应用是多方面的，如DNA分子的体外合成、体外突变、DNA片段探针的标记、DNA序列分析、DNA分子的修复、聚合酶链反应等。常用的DNA聚合酶主要有E.coli DNA聚合酶I、E.coli DNA聚合酶I大片段（Klenow fragment）、T4噬菌体DNA聚合酶，以及耐高温DNA聚合酶等。不同来源的DNA聚合酶具有各自不同的酶学特性。

耐高温的DNA聚合酶最适作用温度为75℃～80℃，目前广泛用于聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）及DNA测序。在DNA末端加上一段限制性内切酶识别的序列，随后用限制性内切酶切出所需要的黏性末端，使DNA平端得以转变为较为容易进行连接的黏性末端。此合成的含限制性内切酶识别序列的DNA片段称接头（linker），通常是一种回文结构的寡核苷酸，在溶液中可自身配对形成双链片段。如果合成的DNA片段具有多种限制性内切酶识别序列，称多接头（polylinker）。如合成两条互补寡核苷酸，使其配对后一端为平末端，另一端为黏性末端，或两端为不同的黏性末端，此合成的片段称衔接头。衔接头可使DNA平末端变成黏性末端，或由一种黏性末端变成另一种黏性末端，并且不需要限制酶切，在基因工程中十分有用。在需要连接的两个DNA分子末端加上互补的同聚尾后，连接反应会变得比较容易一些。

平末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transierase）在2价阳离子存在下可以催化d NTP加于DNA分子的3′端，主要用于给载体或cDNA加上互补的同聚尾或接头，便于外源基因重组，标记DNA片段的3′端等。

（五）逆转录酶

逆转录酶（reverse transcriptase）是一种依赖于RNA的DNA聚合酶。具有5′—3′DNA聚合酶活性，当存在RNA或DNA模板及带3′—OH的RNA或DNA引物时，它催化以RNA为模板合成DNA的反应。

逆转录酶还具有RNA酶H的活性，即5′→3′及3′→5′外切核酸酶活性。利用逆转录酶所具有的RNA酶H的活性，可使RNA-DNA杂交体中的RNA被持续地、特异性地降解掉，从而免去对逆转录后的RNA模板再用NaOH进行水解的步骤。

逆转录酶在基因工程中的用途主要是以真核mRNA为模板合成cDNA，用以组建cDNA文库，进而分离特定蛋白质编码的基因。近年来，将mRNA反转录与PCR偶联建立起来的反转PCR（RT-PCR），使真核基因的分离更加高效。

除以上介绍的工具酶之外，基因工程的操作中需要用到许多其他的工具酶。例如依赖于DNA的RNA聚合酶、T4噬菌体多核苷酸激酶、核苷酸酶BAL 31、S1核酸酶、绿豆核酸酶、核糖核酸酶A（Rnase A）、脱氧核糖核酸酶I（Dnase I）、外切核酸酶Ⅲ等。基因工程酶学已经成为基因工程技术体系的主要内容之一。