电泳分离的应用和优势

电泳技术是一种先进的检测手段，与其他先进技术相配合，能创造出惊人的成果，可使人们用较少代价获得最优效益。例如，它对解决当前人类所面临的食品、能源、环境和疾病等一系列迫切问题都有积极作用，显示出强大的生命力。因此，电泳技术正越来越多地被人们所重视，广泛应用于各个领域。

带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳（electrophoresis）。按其使用的支持体的不同，电泳可以分为纸电泳、薄层电泳、薄膜电泳、凝胶电泳、毛细管电泳和等电聚焦电泳等。

颗粒在电场中的移动速度主要取决于其本身所带的净电荷量，同时受颗粒形状和颗粒大小的影响，此外还受到电场强度、溶液的pH、离子强度及支持体的特性等外界条件的影响。

（1）电场强度：电场强度（electric field strength）是指每厘米距离的电压降，又称为电位梯度或电势梯度。电场强度对颗粒的泳动速度起着十分重要的作用。

根据电场强度的大小可将电泳分为常压电泳和高压电泳。常压电泳的电场强度一般为2～10V/cm，电压为100～500V，电泳时间从几十分钟到几十小时，多用于带电荷的大分子物质的分离；高压电泳的电场强度为20～200V/cm，电压大于500V，电泳时间从几分钟到几小时，多用于带电荷的小分子物质的分离。

（2）溶液的pH：溶液的pH决定了溶液中颗粒分子的解离程度，即决定了颗粒分子所带净电荷的多少。对于两性电解质而言，溶液的pH，不仅决定颗粒分子所带电荷的种类，而且决定净电荷的数量。电泳时，溶液的pH应该选择在适当的数值，并需采用缓冲液，使pH维持恒定。

（3）溶液的离子强度：溶液的离子强度越高，颗粒的泳动速度越慢。一般电泳溶液的离子强度为0.02～0.2较为适宜。

（4）电渗：在电场中，溶液对于固体支持物的相对移动称为电渗（electroosmosis）。

在酶学研究中，电泳技术主要用于酶的纯度鉴定、酶分子质量的测定、酶等电点的测定及少量酶的分离纯化。

（一）纸电泳

纸电泳（paper electrophoresis）是以滤纸为支持物的区带电泳系统。它是在渗透了缓冲液的滤纸上加上电场使物质移动的电泳法。也就是把样品以带状加在作为支持体的滤纸内来检测其移动和分离的方法，常用以分离性质相似的物质。

纸电泳的仪器装置包括电泳槽和电泳仪两大部分。电泳槽是进行电泳的装置，其中包括铂电极（直径为0.5～0.8cm）、缓冲液槽、电泳介质的支架和一个透明的罩。常见的电泳槽有水平式和悬架式等。电泳仪是提供直流电源的装置，它能控制电压和电流的输出。电泳槽内的铂电极经隔离导线穿过槽壁与外接电泳仪电源相连，电源为具有稳压器的直流电源。纸电泳可分为低压电泳和高压电泳两类。低压电泳的电压一般为100～500V，电流为0～150m A；高压电泳的电压一般为500～10 000V，电流为50～400mA。

根据欲分离物质的物理化学性质，选择一定的pH和一定离子强度的缓冲液（如Tris-盐酸缓冲液）。然后，在滤纸的适当位置点好样品，点样量要适当，过多易引起拖尾和扩散现象，过少则难以检测。点好样的滤纸平置于电泳槽的适当位置，接通电源，在一定条件下进行电泳。经过适宜的时间后，取出滤纸，进行显色鉴定或其他方法的分析鉴定。

（二）薄层电泳

薄层电泳（thin layer electrophoresis）是以支持物与缓冲液调制成适当厚度的薄层而进行的电泳技术。常用的支持物有淀粉、纤维素、硅胶、琼脂等，其中以淀粉最为常用。这是由于淀粉易于成型，对蛋白质、核酸的吸附少，样品洗脱容易，电渗作用低，分离效果好。

淀粉板薄层电泳所使用的缓冲液可以与纸电泳相同。但由于淀粉颗粒对离子有一定的吸附作用，所以必须采用离子强度较高的缓冲液。将淀粉与所选用的缓冲液混合均匀后，在玻璃板上制成尺寸适宜的淀粉薄层板。加样时，在淀粉薄板的适当位置用刀片挖出适量淀粉，与样品液混合均匀后重新填回原处压平。用纱布条与两电极槽的缓冲液相连，接通电源，进行电泳。电泳完毕后，用一张与薄层板大小相同的滤纸，用缓冲液浸湿后，平铺在薄层板上，轻轻压平，放置3min后，吹干滤纸染色。

（三）薄膜电泳

薄膜电泳（film electrophoresis）是以醋酸纤维素膜等材料为支持物进行的电泳。其优点为快速、区带清晰、无拖尾、易回收定量、便于保存等，但分辨率较低，已被广泛应用于各种酶的分离。

用于薄膜电泳的薄膜在使用前要经过一定的处理。例如，醋酸纤维素薄膜要切成适当尺寸，放进电泳缓冲液中浸泡30min，充分浸透至薄膜上无白点。置于电泳架上，薄膜两端伸进缓冲液中。用微量注射器将一定量的样品点在薄膜中央，然后接通电源进行电泳0.5～2h。取出薄膜在染色液（氨基黑10B等）中染色5～10min.再用漂洗液（10%乙酸的甲醇溶液）漂洗几次，直至区带清晰为止。

（四）凝胶电泳

凝胶电泳（gel electrophoresis）是以凝胶（如聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等）为支撑物的区带电泳。

凝胶电泳或称胶体电泳是一大类技术，被科学工作者用于分离不同物理性质（如大小、形状、等电点等）的分子。凝胶电泳通常用于分析用途，但也可以作为制备技术，在采用某些方法[如质谱（MS）、聚合酶链反应（PCR）、克隆技术、DNA测序或免疫印迹]检测之前部分提纯分子。

1.聚丙烯酰胺凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有两种——化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵（ammonium persulfate，AP）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构，具有分子筛效应。聚丙烯酰胺胶有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）；非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子质量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳可测定蛋白质分子质量。其原理是：SDS是十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）的简称，它是一种阴离子表面活性剂，加入电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4gSDS∶1g蛋白质），使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，于是根据标准蛋白质分子质量的对数和迁移率所作的标准曲线，可求得未知物的分子质量。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测蛋白质分子质量已经比较成功，此法测定时间短，分辨率高，所需样品量极少（1～100μg），但只适用于球形或基本上呈球形的蛋白质。某些蛋白质不易与SDS结合，如木瓜蛋白酶、核糖核酸酶等，此时测定结果就不准确。

聚丙烯酰胺凝胶电泳根据其有无浓缩效应，又分为连续系统和不连续系统两大类。①连续系统电泳体系中缓冲液pH及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应；②不连续系统中由于缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者为佳。不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCl；分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9的Tris-HCl；电极缓冲液是pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液。两种孔径的凝胶、两种缓冲体系、三种pH使不连续体系形成了凝胶孔径、pH、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。

酶在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷及分子的大小和形状等因素。如果加入一种试剂使电荷因素消除，那么电泳迁移率就取决于分子的大小，就可以用电泳技术测定酶的分子质量。1967年，Shapiro等发现阴离子去污剂SDS具有这种作用。当向酶溶液中加入足够量SDS和巯基乙醇，可使酶分子中的二硫键还原。由于十二烷基硫酸根带负电，使各种酶-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了酶分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种酶间原有的电荷差别，SDS与酶结合后，还可引起构象改变，酶-SDS复合物形成近似“雪茄烟”形的长椭圆棒，不同酶的SDS复合物的短轴长度都一样，约为18A°（1A°=0.1nm），这样的酶-SDS复合物在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原有的电荷和形状的影响，而取决于分子质量的大小。由于酶-SDS复合物在单位长度上带有相等的电荷，所以它们以相等的迁移速度从浓缩胶进入分离胶，进入分离胶后，由于聚丙烯酰胺的分子筛作用，小分子的酶可以容易地通过凝胶孔径，阻力小，迁移速度快；大分子的酶则受到较大的阻力而被滞后，这样酶在电泳过程中就会根据其各自分子质量的大小而被分离。因而SDS-PAGE可以用于测定酶的分子质量。当分子质量为15～200kDa时，酶的迁移率和分子质量的对数呈线性关系，符合下式：log MW=k-bX，式中，MW为分子质量；X为迁移率；k、b均为常数。若将已知分子质量的标准蛋白质的迁移率对分子质量对数作图，可获得一条标准曲线，未知酶在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子质量。

SDS-PAGE经常应用于提纯过程中纯度的检测，纯化的酶通常在SDS电泳上应只有一条带，但如果酶是由不同的亚基组成的，它在电泳中可能会形成分别对应于各个亚基的几条带。SDS-PAGE具有较高的灵敏度，一般只需要不到微克量级的酶，而且通过电泳还可以同时得到关于分子质量的情况，这些信息对于了解未知酶及设计提纯过程都是非常重要的。

光聚合法是利用核黄素作为光聚合催化剂。光聚合可以用日光、日光灯、电灯等作为光源。在微量的氧存在下，核黄素经光解作用形成无色基，无色基再氧化生成自由基，从而引发聚合反应。光聚合形成的孔径较大，且不稳定，适合制备大孔径的浓缩胶。化学聚合法在制胶中用得较多。

2.琼脂糖凝胶电泳(www.xing528.com)

琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖做支持介质的一种电泳方法。对于分子质量较大的样品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。其分析原理与其他支持物电泳的最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。

蛋白质和核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速度不同，根据这个原理可将其分开。电泳缓冲液的pH为6～9，离子强度0.02～0.05为最适。常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2～20kb，利用脉冲电泳，可分离高达7～10bp的DNA片段。

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。

（五）毛细管电泳

毛细管电泳（CE）又称高效毛细质的管电泳（HPCE），是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术。毛细管电泳实际上包含电泳、色谱及其交叉内容，它使分析化学得以从微升水平进入纳升水平，并使单细胞分析，乃至单分子分析成为可能。长期困扰我们的生物大分子，如蛋白分离分析也因此有了新的转机。

毛细管电泳通常使用内径为25～100μm的弹性（聚酰亚胺）涂层熔融石英管。标准毛细管的外径为375μm，有些管的外径为160μm。毛细管的特点是：容积小（一根100cm×75μm管子的容积仅4.4μL）；侧面/截面积比大，因而散热快、可承受高电场（100～1000V/cm）；可使用自由溶液、凝胶等为支持介质；在溶液介质下能产生平面形状的电渗流。

因此，可使毛细管电泳具备如下优点。

（1）高效。塔板数目为105～106片/m，当采用毛细管凝胶电泳（capillary gel electrophoresis，CGE）时，塔板数目可达107片/m以上。

（2）快速。一般在十几分钟内完成分离。

（3）微量。进样所需的样品体积为纳升级。

（4）多模式。可根据需要选用不同的分离模式且仅需一台仪器。

（5）经济。实验消耗不过几毫升缓冲溶液，维持费用很低。

（6）自动。CE是目前自动化程度较高的分离方法。

毛细管电泳的缺点如下。

（1）由于进样量少，因而制备能力差。

（2）由于毛细管直径小，使光路太短，用一些检测方法（如紫外吸收光谱法）时，灵敏度较低。

（3）电渗会因样品组成而变化，进而影响分离的重现性。

（六）等电聚焦电泳

等电聚焦（isoelectric focusing，IEF）是20世纪60年代中期出现的新技术。近年来等电聚焦技术有了新的进展，已迅速发展成为一门成熟的近代生化实验技术。目前，等电聚焦技术已可以分辨等电点（pI）只差0.001pH单位的生物分子。由于分辨力高、重复性好、样品容量大、操作简便迅速，其在生物化学、分子生物学及临床医学研究中得到广泛的应用。

蛋白质分子是典型的两性电解质分子。它在大于其等电点的pH环境中解离成带负电荷的阴离子，向电场的正极泳动，在小于其等电点的pH环境中解离成带正由荷的阳离子，向电场的负极泳动。这种泳动只有在等于其等电点的pH环境中，即蛋白质所带的净电荷为零时才能停止。如果在一个有pH梯度的环境中，对各种不同等电点的蛋白质混合样品进行电泳，则在电场作用下，不管这些蛋白质分子的原始分布如何，各种蛋白质分子将按照它们各自的等电点大小在pH梯度中相对应的位置处进行聚焦，经过一定时间的电泳以后，不同等电点的蛋白质分子便分别聚焦于不同的位置。这种按等电点的大小，生物分子在pH梯度的某一相应位置上进行聚焦的行为就称为等电聚焦。等电聚焦的特点就在于它利用了一种称为两性电解质载体的物质在电场中构成连续的pH梯度，使蛋白质或其他具有两性电解质性质的样品进行聚焦，从而达到分离、测定和鉴定的目的。

两性电解质载体，实际上是许多异构和同系物的混合物，它们是一系列多羧基多氨基脂肪族化合物，相对分子质量为300～1000。常用的进口两性电解质为瑞典Pharmac-LKB公司生产的Ampholine和Pharmalyte，价格昂贵。国产的有中国军事医学科学院放射医学研究所和上海生物化学所生产的两性电解质，价格便宜，质量尚佳。两性电解质在直流电场的作用下，能形成一个从正极到负极的pH逐渐升高的平滑连续的pH梯度。若不同的pH的两性电解质的含量与pI的分布越均匀，则pH梯度的线性就越好。对Ampholine两性电解质的要求是缓冲能力强、有良好的导电性、分子质量要小、不干扰被分析的样品等。

在聚焦过程中和聚焦结束取消了外加电场后，如何保持pH梯度的稳定是极为重要的。为了防止扩散，稳定pH梯度，就必须加入一种抗对流和扩散的支持介质，最常用的这种支持介质就是聚丙烯酰胺凝胶。当进行聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳时，凝胶柱内即产生pH梯度，当蛋白质样品电泳到凝胶柱内某一部位，而此部位的pH正好等于该蛋白质的等电点时，该蛋白质即聚焦形成一条区带，只要测出此区带所处部位的pH，即为其等电点。电泳时间越长，蛋白质聚焦的区带就越集中、越狭窄，因而提高了分辨率。这是等电聚焦电泳的一大优点，不像其他的电泳，电泳时间过长则区带扩散。所以，等电聚焦电泳不仅可以测定等电点，而且能将不同等电点的混合生物大分子进行分离和鉴定。

早期的等电聚焦电泳是垂直管式的，其特点为体系是封闭的，不与空气接触，可防止样品氧化。近年来，又发展了超薄层水平板式等电聚焦电泳，此法的加样数量多，节省两性电解质，电泳后固定、染色、干燥都十分迅速简便，其最大优点是防止了电极液的电渗作用而引起正负两极pH梯度的漂变。另外，Pharmacia-LKB公司、北京生命科学院都有商品胶条出售。

等电聚焦电泳的操作包括以下步骤。

（1）pH梯度支持介质的制备：将两性电解质载体和样品在凝胶聚合之前加到混合液中，然后聚合。样品也可以在凝胶制备好以后，在电泳前加到凝胶表面。

（2）电泳：装置好凝胶柱和电极缓冲液，调好电压（初始电压200～400V，后升至400～800V），接通电源进行电泳，直至电流下降至稳定，一般需要12h左右。

（3）分离组分检测：电泳结束后，取出凝胶，可用表面微电极直接测定不同部位的pH，以确定各部分的等电点；也可以将凝胶切成各小段，对每一组分进行进一步分离；或将取出的凝胶进一步进行SDS凝胶电泳，使各组分在按等电点不同的基础上进一步按照分子质量大小进行分离。