层析分离技术-生物技术与工程概论

层析分离（chromatographic separation）是利用混合液中各组分的物理化学性质（分子的大小和形状、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数等）的不同，使各组分以不同比例分布在两相中。

其中一个相是固定的，称为固定相；另一个相是流动的，称为流动相。当流动相流经固定相时，各组分以不同的速度移动，从而使不同的组分分离纯化。

分离纯化酶采用的层析方法常用的有吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析和亲和层析等，如表2-3所示。

表2-3　层析分离方法

续表

（一）吸附层析

1.吸附层析原理

任何两个相之间都可以形成一个界面，其中一个相中的物质在两相界面上的密集现象称为吸附（adsorption）。凡是能够将其他物质聚集到自己表面上的物质称为吸附剂（sorbent）。吸附剂一般是固体或者液体，在吸附层析中通常应用的是固体吸附剂。固体物质之所以具有吸附作用，是由于固体表面的分子（原子或离子）与固体内部的分子所受到的作用力不相同。

能聚集于吸附剂表面的物质称为被吸附物（adsorptive substance）。吸附剂与被吸附物之间的相互作用力主要是范德华力。其特点是可逆的，即在一定条件下，被吸附物被吸附到吸附剂的表面上；而在另外的某种条件下，被吸附物可以离开吸附剂表面，这称之为解吸作用。

吸附层析通常采用柱型装置，将吸附剂装在吸附柱中，装置成吸附层析柱。层析时，欲分离的混合溶液自柱顶加入，当样品液全部进入吸附层析柱后，再加入洗脱剂解吸洗脱。在洗脱时，层析柱内不断发生解吸、吸附、再解吸、再吸附的过程，移动距离的长短与吸附剂对该物质的吸附力及洗脱剂对该物质的洗脱能力有关。

2.洗脱方法

洗脱方法有溶剂洗脱法、置换洗脱法和前缘洗脱法等。

（1）溶剂洗脱法：是采用单一或者混合的溶剂进行洗脱的方法，是目前应用最广泛的方法。

（2）置换洗脱法：又称为置换法或取代法。所用的洗脱剂是置换洗脱液。

（3）前缘洗脱法：又称为前缘分析法，是连续向吸附层析柱内加入欲分离的混合溶液，即所用的洗脱液为含有各组分的混合溶液本身。

3.吸附剂与洗脱剂的选择

（1）吸附剂的选择。

吸附剂的选择是吸附层析的关键因素，目前尚无固定的法则可循。在实际应用过程中，可以根据前人的经验或者通过小样试验来确定。极性物质容易被极性表面吸附，非极性物质容易被非极性表面吸附，溶液中溶解度越大的物质越难被吸附。吸附剂通常由一些化学性质不活泼的多孔材料制成，比表面积很大，又可分为无机吸附剂和有机吸附剂。常用的吸附剂如活性炭、磷酸钙、碳酸盐、氧化铝、硅藻土、泡沸石、陶土为无机吸附剂；硅胶、聚丙烯酰胺凝胶、葡聚糖、琼脂糖、菊糖、纤维素等为有机吸附剂。此外，还可以在吸附剂上连接亲和基团而制成亲和吸附剂。通常用于酶的分离纯化的吸附剂有硅藻土、氧化铝、磷酸钙、羟基磷灰石和活性炭等。

（2）洗脱剂的选择。

将目的物从吸附剂上洗脱下来，要根据吸附剂的性质和被吸附物的特点来选择合适的洗脱剂。对于极性组分，用极性大的溶剂洗脱效果较好。而对于非极性组分，则用非极性溶剂洗脱较佳。

洗脱剂的种类有：饱和烃、醇、酮、酚、醚、卤代烷、水等。

洗脱剂的选择要注意以下几点。

①洗脱剂不会与吸附剂起化学反应，也不会使吸附剂溶解。

②洗脱剂对混合液中的各组分的溶解度大，黏度小，流动性好，容易与被洗脱的组分分离。

③洗脱剂要求一定的纯度，以免杂质对分离带来不利影响。

（二）分配层析

分配层析（partition chromatography）是利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分离的方法。

分配系数（distribution coefficient）是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两项溶剂中的浓度的比值。在层析条件确定后，分配系数是一个常数，以K表示。

在分配层析中，通常采用一种多孔性固体支持物（如滤纸、硅藻土、纤维素等）吸着一种溶剂为固定相，这种溶剂在层析过程中始终固定在多孔支持物上。另一种与固定相溶剂互不相溶的溶剂可沿着固定相流动，称为流动相。当某溶质在流动相的带动下流经固定相时，该溶质在两相之间进行连续的动态分配。其分配系数为

由于不同的溶质有不同的分配系数，移动速度不同，从而达到分离。

分配层析主要有纸上层析、分配薄层层析、分配气相层析等方法。其中纸上层析和分配薄层层析可在实验室对各种物质组分进行各种定性、定量分析；而气相层析只适用于气体组分的分离和分析检测。

（三）离子交换层析

离子交换层析（ion exchange chromatography）是利用离子交换剂（具有离子交换性能的物质）作为固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的层析方法，即溶液中的离子同离子交换剂上功能基团交换的反应过程。带电量小、亲和力小的先被洗脱下来；带电量多、亲和力大的后被洗脱下来。

离子交换剂是含有若干活性基团的不溶性高分子物质。通过在不溶性高分子物质（母体）上引入若干可解离基团（活性基团）而制成。

按活性基团的性质不同，离子交换剂可以分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。由于酶分子具有两性性质，所以可用阳离子交换剂，也可用阴离子交换剂进行酶的分离纯化。在溶液的pH大于酶的等电点时，酶分子带负电荷，可用阴离子交换剂进行层析分离；当溶液pH小于酶的等电点时，酶分子带正电荷，则要采用阳离子交换剂进行分离。

按母体物质种类的不同，离子交换剂有离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换凝胶等。其中某些大孔径的离子交换树脂、离子交换纤维素和离子交换凝胶可用于酶的分离纯化。

在一定条件下，某种组分离子在离子交换剂上的浓度与在溶液中的浓度达到平衡时，两者浓度的比值K称为平衡常数（也叫分配系数），即

平衡常数K是离子交换剂上的活性基团与组分离子之间亲和力大小的指标。

1.离子交换剂的选择与处理

离子交换剂有不同的种类和型号，在进行离子交换层析前.应当根据欲分离组分的特性和要求选择好离子交换剂。选择离子交换剂时主要考虑因素有：离子交换剂和组分离子的物理化学性质，组分离子所带的电荷种类，溶液中组分离子的浓度高低，组分离子的质量大小，组分离子与离子交换剂的亲和力大小。

一般来说，阳离子只能被阳离子交换剂交换吸附，阴离子只能被阴离子交换剂交换吸附。亲和力大的容易吸附，难于洗脱；亲和力小的难于吸附，容易洗脱。离子质量小的，可以采用高交联度的离子交换树脂进行交换；离子质量大的，宜采用离子交换纤维素、离子交换凝胶或大孔离子交换树脂进行交换。

离子交换的环境条件对分离效果有明显影响。溶液的pH直接决定离子交换剂活性基团及组分离子的解离程度，不但影响离子交换剂进行离子交换的容量，对交换的选择性影响也大。在酶等活性物质的离子交换吸附中，要特别控制好相应的环境条件。过强的吸附和极端的洗脱条件都可能造成活性分子的变性失活。

工厂生产的离子交换剂在使用之前，一般按照下列程序进行处理：干燥离子交换剂用水浸泡2h以上，使之充分溶胀；用无离子水洗至中性；用4倍体积的2mol/L盐酸搅拌浸泡4h，弃酸液，用无离子水洗至中性备用；用4倍体积的2mol/L氢氧化钠搅拌浸泡4h，弃碱液，用无离子水洗至中性；用适当的试剂进行转型处理，使离子交换剂上所带的可交换离子转变为所需的离子。

2.离子交换层析的操作过程

在酶的分离纯化过程中，通常采用离子交换柱进行酶的连续离子交换。其层析分离过程大致分为5个步骤：①离子扩散到树脂表面；②离子通过树脂扩散到交换位置；③在交换位置进行离子交换，被交换的分子所带电荷越多，它与树脂的结合越紧密，也就越不容易被其他离子取代；④被交换的离子扩散到树脂表面；⑤冲洗液通过，被交换的离子扩散到外部溶液中。(www.xing528.com)

离子交换树脂的交换反应是可逆的，遵循化学平衡的规律，定量的混合物通过管柱时，离子不断被交换，浓度逐渐降低，几乎全部都能被吸附在树脂上；在冲洗的过程中，由于连续添加新的交换溶液，所以会朝正反应方向移动，因而可以把树脂上的离子冲洗下来。

（四）凝胶层析

凝胶层析（gel chromatography）又称为凝胶过滤、分子排阻层析、分子筛层析等，是指以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术。

1.凝胶层析的基本原理

凝胶层析柱中装有多孔凝胶，当含有各种组分的混合溶液流经凝胶层析柱时，各组分在层析柱内同时进行两种不同的运动：一种是随着溶液流动而进行的垂直向下的移动；另一种是无定向的分子扩散运动（布朗运动）。

大分子物质由于分子直径大，不能进入凝胶的微孔，只能分布于凝胶颗粒的间隙中，以较快的速度流过凝胶柱。较小的分子能进入凝胶的微孔内，不断地进出于一个个颗粒的微孔内外，这就使小分子物质向下移动的速度比大分子的速度慢，从而使混合溶液中各组分按照相对分子质量由大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的。

为了定量地衡量混合液中各组分的流出顺序，常常采用分配系数Ka来量度。

式中，Ve为洗脱体积，表示某一组分从加进层析柱到最高峰出现时所需的洗脱液体积；VO为外体积，即为层析柱内凝胶颗粒空隙之间的体积；VI为内体积，即为层析柱内凝胶颗粒内部微孔的体积。

如果某组分的分配系数Ka=0，即Ve=VO，说明该组分完全不能进入凝胶微孔，洗脱时最先流出；如果某组分的分配系数Ka=1，即Ve=VO+VI，说明该组分可以自由地扩散进入凝胶颗粒内部的所有微孔，洗脱时最后流出；如果某组分的分配系数Ka在0～1，说明该组分分子大小介于大分子和小分子之间，可以进入凝胶的微孔，但是扩散速度较慢，洗脱时按照Ka值由小到大的顺序先后流出。

酶、右旋糖酐、球蛋白等，都有其各自特定的选择曲线。

2.凝胶的选择与处理

凝胶材料主要有葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺等。

层析用的微孔凝胶是由凝胶材料与交联剂交联聚合而成的。交联剂加得越多，载体颗粒的孔径就越小。常使用的交联剂有环氧氯丙烷等。

葡聚糖凝胶：一般由相对分子质量为4×104～20×104的葡聚糖为单体，以1，2-环氧氯丙烷为交联剂，交联聚合而成。商品名称有多种，如Sephadex等。葡聚糖凝胶具有良好的化学稳定性，在碱性条件下非常稳定，在0.01mol/L的盐酸中放置半年不受影响，可以耐受120℃甚至更高的温度，广泛应用于各种物质的分离纯化。

琼脂凝胶与琼脂糖凝胶：琼脂凝胶是一种天然多孔凝胶，其内部孔径较大，允许较大的分子进出，因此其用作凝胶层析时的工作范围大于聚丙烯酰胺凝胶和葡聚糖凝胶。

聚丙烯酰胺凝胶：是一种人工合成的凝胶，由丙烯酰胺（CH2=CH—CONH2）和甲叉双丙烯酰胺（CH2=CH—CONH—CH2—NHCO—CH—CH2）共聚而成。商品名称有多种，如生物胶-P（Bio-gel P）等。聚丙烯酰胺是一种惰性凝胶，适合于各种酶、蛋白质、核酸等的分离纯化；缺点是遇强酸时，会使其中的酰胺键水解而结构破坏。一般在pH为2～11的范围内使用。

选择凝胶主要是依据欲分离组分的分子质量的大小。

3.凝胶层析操作过程

凝胶层析的操作一般包括装柱、上柱、洗脱等过程。

（五）亲和层析

亲和层析（affinity chromatography）是利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，而使生物分子分离纯化的技术。

亲和层析的选择性很高，酶与底物、酶与竞争性抑制剂、酶与辅助因子、抗原与抗体、酶RNA与互补的RNA分子或片段，RNA与互补的DNA分子或片段等之间，都是具有专一而又可逆的亲和力的生物分子对。

由于生物大分子和配基之间的结合是专一性的，故选择性非常好，可通过一次纯化分离步骤得到纯度很高的产品。亲和层析技术的特点是可减少提纯步骤。

1.亲和层析母体和配基

在亲和层析中，作为固定相的一方称为配基（1igand），配基必须偶联于不溶性母体（matrix）上，母体又称为载体或担体。

在亲和层析中一般采用琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶或纤维素等作为母体。当小分子物质（金属离子等无机辅助因子、有机辅助因子等）作为配基时，由于空间位阻作用，难以与配对的大分子亲和吻合，需要在母体与配基之间引入适当长度的连接臂（space arm）。

要使不溶性母体与配基偶联或通过连接臂与配基偶联，都必须进行母体活化，即通过某种方法，如溴化氰法、叠氮法、高碘酸氧化法、环氧化法、甲苯磺酰氯法、双功能试剂法等，使母体引入某种活泼基团，才能以共价键与配基偶联。

2.亲和层析的分类

根据欲分离组分与配基的结合特性，亲和层析可以分为共价亲和层析、疏水层析、金属离子亲和层析、免疫亲和层析、染料亲和层析、凝集素亲和层析等。

①共价亲和层析（covalent affinity chromatography）。

共价亲和层析是生物分子中的功能基团与层析剂上配基形成可逆性的共价键的一种分离层析方法。例如，巯基化合物中的—SH可与另一个—SH结合形成二硫键（—S—S—）。—SH与—S—S一组成一组氧化还原体系，巯基-二硫键共价交换反应是可逆的。因此，酶分子上的巯基可以与亲和层析剂上的巯基之间形成二硫键共价结合，然后可用巯基乙醇、L-半胱氨酸、谷胱甘肽及二硫苏糖醇等小分子巯基化合物进行洗脱。

②疏水层析（hydrophobic chromatography）。

疏水层析是生物分子中的功能性基团与层析剂上配基形成可逆性的疏水键结合的一种亲和层析方法。酶蛋白通常含有较强疏水性的氨基酸，如亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸等。采用氨基烷烃与BrCN活化的琼脂糖进行反应，就可形成改性的琼脂糖。酶蛋白可以与亲和层析剂上改性琼脂糖的烷基发生疏水结合反应，从而得以分离。将一系列长度不同的碳氢化合物接到琼脂糖载体上，从而得到一系列相应的疏水性琼脂糖层析剂，可用它们分离纯化某些酶和蛋白质。

③金属离子亲和层析（metal ion affinity chromatography）。

金属离子亲和层析是利用生物分子中的功能性基团与层析剂上金属离子形成可逆性结合的一种亲和层析方法。金属螯合亲和层析（MCAC）是近30年来出现的一种亲和层析技术，也称固相化金属离子亲和层析。它于1975年首先被Porath和他的合作者们成功用于分离纯化人血清蛋白，并在此后的30年里迅速发展。该方法是利用蛋白质表面暴露的一些氨基酸残基和载体之上的金属离子之间的相互作用而进行的亲和纯化。它以配基简单、吸附量大、分离条件温和、通用性强等特点，逐渐成为分离纯化蛋白质等生物工程产品最有效的技术之一。目前，对于MCAC的研究主要集中在新的金属螯合基质的研究以及层析条件的优化等方面。另外，研究发现，MCAC不仅适于某些蛋白质、酶和氨基酸与肽的分离纯化，也适用于能可逆螯合金属离子的核苷酸、激素、抗体等物质的分离和纯化。随着对金属螯合技术的进一步研究开发，其应用也必将越来越广泛。

④免疫亲和层析（immunoaffinity chromatography）。

免疫亲和层析是利用抗原、抗体之间专一而又可逆的亲和力使抗体或抗原分离纯化的一种亲和层析方法。用适当方法将抗原（或抗体）结合到母体上，制成亲和层析剂，便可用来高效分离和纯化与其互补的抗体（抗原）。例如，将抗原结合于亲和层析基质上，就可以从血清中分离其对应的抗体。在蛋白质工程菌发酵液中所需蛋白质的浓度通常较低，用离子交换、凝胶过滤等方法都难于进行分离，而亲和层析则是一种非常有效的方法。将所需蛋白质作为抗原，经动物免疫后制备抗体，将抗体与适当基质偶联形成亲和吸附剂，就可以对发酵液中的所需蛋白质进行分离纯化。抗原、抗体间亲和力一般比较强，其解离常数为108～1012mol/L，所以洗脱时是比较困难的，通常需要较强烈的洗脱条件。可以采取适当的方法，如改变抗原、抗体种类或使用类似物等来降低二者的亲和力，以便于洗脱。

⑤染料亲和层析（dye affinity chromatography）。

染料亲和层析是利用生物分子中的功能基团与层析剂上的染料配基形成可逆性结合的一种亲和层析方法。一些有机染料如蒽醌化合物、偶氮化学物等，具有类似于NAD+的结构。一些需要核苷酸类似物为辅酶的酶对这些染料有一定的亲和力。该法已经成功用于以NAD+、NADP+、ATP为辅酶的多种酶的分离纯化。

⑥凝集素亲和层析（1ectinaffinitychromatography）。

凝集素亲和层析是将凝集素以共价形式与不溶性载体相连接作为亲和吸附剂的层析技术。可用于从混合物中分离或分析糖类及糖复合物，如多糖、糖蛋白、细胞膜碎片、酶、抗体复合物等。

（六）层析聚焦

层析聚焦（chromatofocusing）是将酶等两性物质的等电点特性与离子交换层析的特性结合在一起，实现组分分离的技术。

在层析系统中，柱内装上多缓冲离子交换剂，当加进两性电解质载体的多缓冲溶液流过层析柱时，在层析柱内形成稳定的pH梯度。欲分离酶液中的各个组分在此系统中会移动到（聚焦于）与其等电点相当的pH位置上，从而使不同等电点的组分得以分离。