离心方法的选用及离心机速度和时间对分离效果的影响

离心分离（centrifugal separation）是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的过程。在离心分离时，要根据欲分离物质及杂质的颗粒大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。

（一）离心机的选择

离心机通常按照离心机的最大转速的不同进行分类，可以分为常速（低速）离心机、高速离心机和超速离心机三种。

常速离心机（低速离心机）：最大转速在8000r/min以内，相对离心力（RCF）在1×104g以下，主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离。也用于酶的结晶等较大颗粒的分离。

高速离心机（设有冷冻装置）：最大转速为1×104～2.5×104r/min，相对离心力达到1×104～1×105g，主要用于沉淀细胞碎片和细胞器等的分离。

超速离心机：最大转速达2.5×104～12×104r/min，相对离心力可以高达5×105g，甚至更高，主要用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分子及细胞器、病毒等的分离纯化，样品纯度的检测，沉降系数和相对分子质量的测定，等等。

（二）离心方法的选用

对于常速离心机和高速离心机，由于所分离的颗粒大小和密度相差较大，只要选择好离心速度和离心时间，就能达到分离效果。

如果希望从样品液中分离出两种以上大小和密度不同的颗粒，需要采用差速离心方法。而对于超速离心，则可以根据需要采用差速离心、密度梯度离心或等密梯度离心等方法。

1.差速离心

差速离心（differential centrifugation）是指采用不同的离心速度和离心时间，使不同沉降速度的颗粒分批分离的方法。

2.密度梯度离心

密度梯度离心（density gradient centrifugation）是样品在密度梯度介质中进行离心，使沉降系数比较接近的物质分离的一种区带分离方法。

为了使沉降系数比较接近的颗粒得以分离，必须配制好适宜的密度梯度系统。密度梯度系统是在溶剂中加入一定的溶质，这种溶质称为梯度介质。常用的梯度介质有蔗糖、甘油等。使用最多的是蔗糖密度梯度系统，其适用范围是：蔗糖浓度5%～60%，密度范围为1.02～1.30g/cm3。

密度梯度一般采用密度梯度混合器进行制备。制备得到的密度梯度可以分为线性梯度、凹形梯度和凸形梯度等。

离心后不同大小、不同形状、具有一定沉降系数差异的颗粒在密度梯度溶液中形成若干条界面清楚的不连续区带。

3.等密梯度离心

当欲分离的不同颗粒的密度范围处于离心介质的密度范围内时，在离心力的作用下，不同浮力密度的颗粒或向下沉降，或向上漂浮，只要时间足够长，就可以一直移动到与它们各自的浮力密度恰好相等的位置（等密度点），形成区带。这种方法称为等密梯度离心（isopycnic density gradient centrifugation）或称为平衡等密度离心。

等密梯度离心常用的离心介质是铯盐，如氯化铯（CsCl）、硫酸铯（Cs2SO4）、溴化铯（CsBr）等。有时也可以采用三碘苯的衍生物作为离心介质。(www.xing528.com)

（三）离心条件的确定

选择好离心力（或离心速度）和离心时间。

1.相对离心力

低速离心一般可以用离心速度，即转子每分钟的转数表示，如5000r/min等。

在高速离心，特别是超速离心时，往往以相对离心力表示，如60 000g等。相对离心力（relative centrifugal force，RCF）是指颗粒所受到的离心力与地心引力之比值，即

式中，RCF为相对离心力（g）；Fc为离心力；Fg为地心引力；n为转子每分钟转数（r/min）；r为旋转半径（cm）。

2.离心时间

对于常速离心、高速离心和差速离心来说，离心时间（centrifugal time）是指颗粒从离心管中样品液的液面完全沉降到离心管底的时间，称为沉降时间或澄清时间；对于密度梯度离心而言，离心时间是指形成界限分明的区带的时间，称为区带形成时间（zone time）；等密梯度离心所需的离心时间是指颗粒完全达到等密度点的平衡时间，称为平衡时间（equilibration time）。

最常用到的是沉降时间。沉降时间（sedimentation time）是指颗粒从样品液面完全沉降到离心管底所需的时间。沉降时间取决于颗粒的沉降速度和沉降距离。

对于已经知道沉降系数的颗粒，其沉降时间可以用下列公式计算：

式中，t为沉降时间（s）；S为颗粒的沉降系数（s）；叫为转子角速度（rad/s）；r1、r2为分别为旋转轴中心到样品液液面和离心管底的距离（cm）。

上式中括号内部分可以用转子因子K表示，即

转子的效率因子K与转子的半径和转速有关。生产厂家已经在转子出厂时标示出了最大转速时的K值。据此，可以根据公式ω21K1=ω22K2计算出其他转速时的K值。对于某一具体的颗粒来说，沉降系数S为定值，所以K值越小，其沉降时间就越短，转子的使用效率就越高。

3.温度和pH

在离心过程中，为了防止欲分离物质的凝聚、变性和失活，除了在离心介质的选择方面加以注意外，还必须控制好温度和pH等条件。

离心温度一般控制在4℃左右，对于某些耐热性较好的酶，也可以在室温条件下进行离心分离。对于超速离心，由于转子高速旋转会发热而引起温度升高，必须采用冷却系统，使温度保持在一定范围内。

离心介质的pH必须是处于酶稳定的pH范围内，必要时可以采用缓冲溶液。