常用于酶分离的沉淀方法及其pH影响

沉淀分离（precipitated separation）是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低而从溶液中沉淀析出，与其他溶质分离的技术过程。

沉淀分离是酶的分离纯化过程中经常采用的方法。沉淀分离的方法主要有盐析沉淀法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、复合沉淀法、选择性变性沉淀法等。

（一）盐析沉淀法

盐析沉淀法简称盐析法（salting-out method），是利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离的过程。

蛋白质在水中的溶解度受到溶液中盐浓度的影响。

一般在低盐浓度的情况下，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加，这种现象称为盐溶。而在盐浓度升高到一定浓度后，蛋白质的溶解度又随盐浓度的升高而降低，结果使蛋白质沉淀析出，这种现象称为盐析。

盐之所以会改变蛋白质的溶解度，是由于盐在溶液中离解为正离子和负离子。由于反离子作用，使蛋白质分子表面的电荷改变，同时由于离子的存在改变了溶液中水的活度，使分子表面的水化膜改变。

酶在溶液中的溶解度与溶液的离子强度关系密切。它们之间的关系可用下式表示：

式中，S为酶或蛋白质在离子强度为I时的溶解度（g/L）；So为酶或蛋白质在离子强度为0时（即在纯溶剂中）的溶解度（g/L）；Ks为盐析系数；I为离子强度。

在温度和pH一定的条件下，So为一常数。所以上式可以改写为

1gS=1gS0-KsI=β-KsI

式中，β=1gS0主要取决于酶或蛋白质的性质，也与温度和pH有关。当温度和pH一定时，β为一常数。Ks为盐析系数，主要取决于盐的性质。Ks的大小与离子价数成正比，与离子半径和溶液的介电常数成反比，也与酶或蛋白质的结构有关。离子强度I是指溶液中离子强弱的程度，与离子浓度和离子价数有关，即

式中，mi为离子强度（mol/L）；Zi为离子价数。

对于含有多种酶或蛋白质的混合液，可以采用分段盐析的方法进行分离纯化。

在一定的温度和pH条件下（β为常数），通过改变离子强度使不同的酶或蛋白质分离的方法称为Ks分段盐析；而在一定的盐和离子强度的条件下（KsI为常数），通过改变温度和pH，使不同的酶或蛋白质分离的方法，称为β分段盐析。

在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等。其中以硫酸铵最为常用。(www.xing528.com)

在盐析时，溶液中硫酸铵的浓度通常以饱和度表示。饱和度是指溶液中加入的饱和硫酸铵的体积与混合溶液总体积之比值。

（二）等电点沉淀法

利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的方法称为等电点沉淀法（isoelectric point precipitation method）。

由于在等电点时两性电解质分子表面的水化膜仍然存在，在实际使用时，等电点沉淀法往往与其他方法一起使用。

在加酸或加碱调节pH的过程中，要一边搅拌一边慢慢加进，以防止局部过酸或过碱而引起的酶变性失活。

（三）有机溶剂沉淀法

利用酶与其他杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的方法称为有机溶剂沉淀法（organic solvent precipitation）。

有机溶剂之所以能使酶沉淀析出是由于有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低。

常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等。有机溶剂的用量一般为酶液体积的2倍左右，不同的酶和使用不同的有机溶剂时，有机溶剂的使用浓度有所不同。

有机溶剂沉淀法的分离效果受溶液pH的影响，一般应将酶液的pH调节到欲分离酶的等电点附近。

（四）复合沉淀法

在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离的方法称为复合沉淀法。常用的复合沉淀剂有单宁、聚乙二醇、聚丙烯酸等高分子聚合物。

（五）选择性变性沉淀法

选择一定的条件使酶液中存在的某些杂蛋白等杂质变性沉淀，而不影响所需的酶，这种分离方法称为选择性变性沉淀法。根据酶和所含杂质的特性，通过加热或改变pH或加进某些金属离子等使杂蛋白变性沉淀而除去。在应用该法之前，必须对欲分离的酶以及酶液中的杂蛋白等杂质的种类、含量及其物理和化学性质有比较全面的了解。