培养基和培养条件对产酶的影响与调节

（一）培养基成分对产酶的影响

由于酶是蛋白质，酶的形成也是蛋白质的合成过程，因此微生物产酶的培养基要有利于蛋白质的合成。大多数工业用酶的合成受底物的诱导和分解代谢物的阻遏双重调节作用，为提高酶产量，应向培养基中添加适量的诱导物，并尽量减少阻遏物的浓度。另外，各种营养物质的比例要适当，应注意到有些微生物生长繁殖的培养基不一定有利于酶的合成，也就是说生长繁殖与产酶可能需要两种不同组分的培养基。同时，还应创造一个适于微生物生长和产酶的营养条件。

1.碳源

碳源是微生物细胞生命活动的基础，是合成酶的主要原料之一。工业生产上应考虑原料的价格及来源，通常使用各种淀粉及它们的水解物如糊精、葡萄糖等作为碳源。此外，各种微生物利用碳源的能力不相同，有的可以利用多种碳源进行生长和产酶；有的却只有利用某种特定的碳源才能进行酶的合成，如链霉菌生产葡萄糖异构酶需要D-木糖或木聚糖。通常，生产与分解代谢有关的酶类，不宜使用葡萄糖等易被利用的碳源为培养基，也不宜提供太丰富的碳源营养，否则可能导致分解代谢产物阻遏。某些碳源是酶的诱导物，选择适宜的碳源有利于定向地促进某些酶的合成，如在毕赤酵母表达系统中，采用醇氧化酶AOX启动子的诱导型表达载体表达外源酶蛋白，外源酶蛋白基因在甲醇以外的碳源中处于非表达状态，而在培养液中加入甲醇后，外源基因即被诱导高效表达。

2.氮源

氮是组成细胞蛋白质和核酸的重要元素之一，也是酶分子的主要组成元素。氮源可分为有机氮和无机氮，有机氮源主要是各种蛋白质及其水解产物；无机氮源是含氮的无机化合物。选用何种氮源因微生物或酶种类的不同而异，如用于生产蛋白酶、淀粉酶的发酵培养基，多数以豆饼粉、花生饼粉等有机氮源为主。各种微生物对氮源的利用情况相当复杂。例如，用橘青霉（Penicillium citrirum）生产5′-磷酸二酯酶，菌体的生长和产酶都以有机氮效果为好。有的菌株却倾向利用无机氮，如以黑曲霉生产葡萄糖淀粉酶，用硝酸盐可使其产酶效率显著提高。还有一类情况，菌体生长和产酶对氮源要求不同，如有机氮可促进绿色木霉（Trichoderma viride）生长，而铵盐或硝酸盐却有利于其纤维素酶的合成。此外，氮源的具体性质、使用浓度都能对菌体生长和酶的形成带来不同程度的影响。

碳氮比（C/N）在某些情况下对菌的生长和产酶也有直接影响。较低的C/N常有利于蛋白酶产量的提高，但是这种条件下，发酵后期的pH往往会升高，反过来又会抑制蛋白酶的积累，因此选择合适的C/N也是提高酶产量的一个重要因素。

3.无机盐类

无机盐的主要作用是提供细胞生命活动所不可缺少的无机元素，并对培养基的pH、氧化还原电位、渗透压起着调节作用。金属离子及其对应的阴离子或直接参与细胞物质的组成或作为酶的活性组成部分与活化剂发挥作用。在酶的形成过程中，它们可能起促进作用，也可能起抑制作用。例如，链霉菌生产葡萄糖异构酶时，当Co2+浓度小于5×10-3mo1/L时能显著提高葡萄糖异构酶的产量，但当大于5×10-3mol/L时，它的效果却是负效应。根据细胞需要量的大小，无机元素可分为主要元素（大量元素）和微量元素两大类。主要元素有磷、硫、钾、钠、镁、钙等，微量元素有铜、锰、锌、钼、钻、碘等。

4.生长因子

生长因子是指细胞生长必需的微量有机化合物，主要包括各种氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素及生长激素等。各种氨基酸是蛋白质和酶的组分，嘌呤和嘧啶是核酸和某些辅酶的组分，维生素主要扮演辅酶的作用，生长激素调节着细胞的生长和代谢。在产酶菌的培养过程中，如果添加含有某种生长因子的物质，常可使酶产量大大提高。例如，在培养基中添加大豆乙醇提取物，可以使米曲霉的蛋白酶产量提高近2倍，使泡盛曲霉（Aspergillus awamori）的脂肪酶提高约1.5倍。在酶的发酵生产中，通常在培养基中加入玉米浆、酵母抽提物和麦芽浸膏等，以提供各种必需的生长因子。

5.产酶促进剂

某些表面活性剂能增加酶的产量，如添加0.1%吐温80，可提高多种酶的产量。表面活性剂提高酶产量的作用机制目前还未完全了解。生产上使用表面活性剂必须考虑对微生物是否有毒性，一般非离子表面活性剂对微生物几乎无毒性，生产上提高胞外酶产量的活性剂一般都采用非离子表面活性剂。产酶的促进剂很多，常见的有吐温80、植酸（菲汀）、洗净剂LS（脂肪酰胺磺酸钠）、聚乙烯醇、乙二胺四乙酸（EDTA）等。

（二）培养条件对产酶的影响与调节控制

1.温度对产酶的影响与调节控制

温度是影响细胞生长繁殖和发酵产酶的重要因素之一。不同的微生物有各自不同的最适生长温度。很多微生物发酵产酶的最适温度与生长最适温度有所不同，而且往往低于生长最适温度。这是由于较低的温度条件可以提高酶所对应的mRNA的稳定性，增加酶生物合成的延续时间，从而提高酶的产量。

酶的发酵生产在不同阶段可以采用不同的温度条件，进行变温发酵。在细胞生长繁殖阶段控制温度处于生长最适温度范围内，以利于提高细胞浓度；在产酶阶段，则需要将温度控制在最佳产酶温度，以利于提高酶产量。例如，以枯草芽孢杆菌进行中性蛋白酶生产时，培养温度从31℃逐渐升温至40℃，然后再降温至31℃进行培养，蛋白酶产量比不升温时提高66%。(www.xing528.com)

2.pH对产酶的影响与调节控制

发酵过程中培养液的pH是微生物在一定条件下代谢活动的综合指标，它对菌体生长和产物积累有很大的影响。因此，在配制培养基和发酵过程中应根据微生物的需要调节pH，及时监测并加以控制，使它处于最佳的状态。

在一般情况下，多数细菌、放线菌生长的最适pH为中性至微碱性，而霉菌、酵母菌则偏好微酸性。培养基的pH不仅影响微生物的生长和产酶，而且对酶的分泌也有作用。很多微生物能同时产生几种相关的酶，改变培养基的pH，可能影响到各种酶的比例。例如，用黑曲霉生产葡萄糖淀粉酶，当pH近中性时a-淀粉酶活力高，葡萄糖淀粉酶合成量较少；当pH偏酸时糖化酶产量上升，而a-淀粉酶、葡萄糖苷转移酶的产量下降。

pH的调节可以通过改变培养基组分或比例来实现，使发酵过程的pH变化在合适的范围内。在培养基配制过程中加入pH缓冲物质，一定程度上可以稳定发酵过程中pH的作用。如添加的CaCO3能与有机酸等反应，起到缓冲作用。还可以在发酵过程中流加酸、碱溶液或是通过补料来调节发酵液中的pH。现在常用的是补加酸性物质（NH4）2SO4或碱性物质氨水，可以起到补充氮源和调节pH的双重目的。此外，也可以采用提高空气流量加速有机酸的代谢，达到调节pH的作用。

3.溶解氧对产酶的影响与调节控制

细胞的生长繁殖及酶的合成过程需要消耗大量能量，这些能量一般是由ATP等高能化合物提供，而培养基中的能源主要经过细胞有氧分解才能获得ATP，因此发酵过程中必须供应大量的氧气。在培养基中生长的产酶细胞，一般只能利用溶解在培养基中的氧气——溶解氧，各种微生物对发酵液中溶解氧浓度有一个不影响其正常代谢的最低要求，这一浓度叫作“临界氧浓度”。当溶解氧浓度低于临界氧浓度时，细胞得不到所需的供氧量，必然影响其生长和产酶；然而溶氧过高，有时对发酵也不利，一方面造成能源浪费，另一方面可能会影响菌丝生长及酶的合成。例如，过度通气对青霉素酰化酶的生产会有明显的抑制作用，而且在剧烈搅拌和通气下容易引起酶蛋白发生变性失活。利用细菌进行酶生产时，一般培养后期的通气搅拌程度应比前期加强，但也有例外的情况，例如，利用枯草芽孢杆菌生产a-淀粉酶，在对数生长期末期降低通气量可促进a-淀粉酶生产。

为了提高发酵液中溶解氧浓度，通常采取以下办法：①提高氧分压。增加进气压力，或者提高空气中氧含量（如输入富氧空气或纯氧），或者添加氧载体。氧载体（Oxygen-Vector）是一种与水不互溶、对微生物无毒、具有较高溶氧能力的有机物。例如，在E.coli发酵生产L-天冬酰胺酶过程中，加入5%的正十二烷作为氧载体，明显改善了供氧条件，增加菌体浓度，使产物酶活提高了21%左右。②增加通气量。通气量是指单位时间内流经培养液的气体量，通气量增大时，可提高溶氧速率。③延长气液接触时间、增加气液接触面积。氧气溶解到培养基中是通过气液两相的界面进行，增加反应器高度、增设挡板等方法可以延长气液接触时间；搅拌装置、气体分配管和挡板可以使发酵液中的气泡打碎、分散，增加气液接触面积，从而提高溶解氧浓度。④改变培养液的性质。通过改变培养液的组分或浓度等方法，降低发酵液黏度，或添加消泡剂等措施减少和消除泡沫的影响，以提高溶氧速率。

4.泡沫对产酶的影响与调节控制

在发酵过程中，由于培养基中有蛋白质类表面活性剂的存在，在通气条件下，会形成泡沫，而且形成的泡沫往往持久性很强。泡沫的存在带来很多不利因素，如阻碍二氧化碳的排除，直接影响到氧的溶解，进而影响微生物的生长繁殖和代谢产物的生成；泡沫层过高，往往造成发酵液随泡沫溢出罐外，不但浪费原料，还会感染杂菌，造成更大损失；又因上升，发酵罐的装料量也将受到限制，从而降低发酵罐的利用率。因此必须采取控制泡沫的措施。控制泡沫方法主要有以下3种。

（1）选育不易产生泡沫的菌种。

（2）调节培养基中营养成分，减少或缓加易起泡的原料。

（3）机械消泡或消泡剂消泡，这是使用最广泛的方法。机械消泡，又分为罐内、罐外消泡两种，但效果不如化学消泡那么显著；采用消泡剂进行消泡即化学消泡。消泡剂的作用机制有两个方面，一是加入消泡剂后，可降低气泡表面张力，使气泡破裂，二是改变其电荷性质，降低气泡的机械强度。我国酶发酵生产中常用的消泡剂为天然油类、甘油聚醚（聚氧丙烯甘油醚）、泡敌（聚环氧丙烷环氧乙烷甘油）和有机硅消泡剂（聚有机硅氧烷）。

微生物发酵产酶过程中，泡沫的消长在正常情况下有一定规律，一般是随着菌体的旺盛生长繁殖和代谢产物（酶）的大量积累而上升。消泡剂的添加应根据泡沫上升程度而定。消泡剂的添加以勤加、少加效果较好，不宜一次大量添加；如果添加过量，不仅抑制菌体生长和产酶，而且影响酶蛋白的提取。

5.湿度对产酶的影响与调节控制

湿度是固体发酵过程控制的重要参数，它直接影响微生物产酶量，也与产酶达到高峰的时间有关。培养物料的湿度高低，视菌株和所产酶的不同而异。对于特定菌株，培养过程的不同时期，对湿度要求也不一样。在微生物固体产酶过程中，一般来说，培养前期降低湿度，培养后期增加湿度，这样有利于产酶。