食品酶制剂生产菌种选择及酶活测定

（一）产酶微生物的种类

用于工业产酶的微生物种类很多，可以分为细菌、放线菌、酵母菌和霉菌四大类。

1.细菌

细菌是单细胞原核微生物。酶制剂工业生产中以E.coli、芽胞杆菌应用最为广泛，如E.coli产青霉素酰化酶和L-天冬酰胺酶等，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）产中性蛋白酶和中温仪-淀粉酶等，地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）产耐高温a-淀粉酶等。此外，目前已普遍利用基因工程技术改造产酶细菌菌株，主要用于生产的细菌表达体系为E.coli、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌等。

2.放线菌

放线菌也是原核生物，细胞结构与细菌类似，但放线菌能形成菌丝，并以产生孢子的形式繁殖。放线菌能够产生多种商品酶，如葡萄糖异构酶和谷氨酰胺转氨酶等。

3.酵母菌

酵母菌是单细胞真核微生物。在现代工业生产中，酵母菌的应用很广泛，除了生产酶制剂，还用于酿酒等。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是发酵工业中最常用的菌种之一，可以用于生产凝血激酶、尿激酶等药用酶。巴斯德毕氏酵母（Pichia pastoris）是真核高效表达蛋白的菌株，通过基因工程改造，工程菌株可用于生产植酸酶、木聚糖酶和甘露聚糖酶等。

4.霉菌

霉菌是一类形成菌丝体的真菌。霉菌在自然界分布极为广泛，具有较强、较完整的酶系，可用于发酵生产多种酶类。黑曲霉（Aspergillus niger）、米曲霉（Aspergillue oryzae）能够生产a-淀粉酶、糖化酶、乳糖酶和脂肪酶等；里氏木霉（Trichoderma reesei）用于生产木聚糖酶和纤维素酶等；青霉（Penicillium）可以生产葡萄糖氧化酶和5′-磷酸二酯酶等。目前，黑曲霉、米曲霉、里氏木霉等已广泛应用于异源蛋白表达。

（二）产酶微生物的要求

任何生物都能在一定的条件下合成酶，但不是所有的菌种都能够用于酶的发酵生产，酶的生产菌种通常需要符合以下条件。

（1）酶的产量高。

（2）容易培养和管理，产酶细胞容易生长繁殖，适应性较强，便于管理。

（3）菌株遗传性要稳定，不易变异退化，不易感染噬菌体，保证生产的稳定性。

（4）菌株能利用廉价原料，发酵周期短，生产成本低。

（5）发酵产物利于酶产品的分离纯化，最好是分泌型的胞外酶。

（6）菌株安全可靠，不是病原菌，不产毒素及其他有害物质，不影响生产人员的身体健康。

（7）基因工程菌株必须符合安全性要求。

酶蛋白作为天然提取物通常被认为是安全的，但由于酶的分离纯化过程中有可能带入一些致病毒素，因此，酶制剂在生产时要通过安全检查。表2-1为我国食品酶制剂的安全国家标准检测指标。对于医药和食品用酶，产酶微生物的安全性就更加重要。食品酶制剂必须通过口服、致癌试验、生产菌病原试验、皮肤刺激性试验等毒性试验才能用于生产。用于食品工业用酶的细菌和真菌，如枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、黑曲霉等，不产生已知的毒素，有充分的安全记录。如果一种生物体不在法规机构的“GRAS（公认为安全的）”生产或加工清单中，未经安全试验，是不允许生产的。

表2-1　我国食品酶制剂安全国家标准检测指标

续表

（三）产酶微生物的分离

筛选到性能优良的产酶菌种是酶发酵生产的先决条件。菌种的筛选方法主要包括以下几个步骤：含菌样品的采集、菌种的分离纯化、产酶性能测定等。

1.含菌样品的采集

根据所要分离的微生物生态特点，可以从自然界中采样，分离产酶微生物菌种。产酶菌的分布大致有如下规律。

（1）相近菌种产生的酶性质一般相近或相似。例如，从地衣芽孢杆菌得到的蛋白酶就和从淀粉液化芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）得到的蛋白酶很相似，因为两者是近缘菌。

（2）胞外酶的稳定性和最适条件通常和菌的最适生长条件接近。例如，嗜碱的枯草芽孢杆菌来源的蛋白酶，其最适pH比嗜中性的地衣芽孢杆菌来源的蛋白酶高几个pH单位；同样，从耐热的凝结芽孢杆菌（B.coagulans）得到的a-淀粉酶，其作用的最适温度可比常温的淀粉液化芽孢杆菌来源的高10℃左右。但是胞内酶的热稳定性常比该菌的最适生长温度要稍低一些，这可能与细胞内环境对酶的保护作用有关。

（3）为获得能够降解某种物质的产酶菌株，一般可从该物质分布比较丰富的地方寻找。例如，包含木质素酶、纤维素酶的产酶菌株在森林和木材堆积的地方较丰富；要降解某些合成物质的产酶菌则往往能在合成工厂污水处理车间污泥及附近土样中筛选获得。

含菌样品采集后，通常还要进行一些“富集”预处理。例如，在较高温度条件培养一定时间，或使用高选择性培养基培养一段时间，以提高所需菌种的数量。然后再进行菌种的分离纯化。还可以在筛选培养基中添加专一性的抑制剂，以达到抑制无关微生物生长的目的，如筛选霉菌时，可以添加青霉素、链霉素等抗生素，以抑制细菌生长，同时不干扰霉菌生长繁殖。

2.菌种的分离纯化

与其他发酵物质产生菌株的分离纯化方法一样，产酶菌种也可采用平板画线法和稀释分离法进行分离纯化。对于胞外酶的生产菌种，经常采用分离与定性和初步定量测定酶活相结合的方法，使在分离时就能大致了解菌种的产酶性能。

3.产酶性能测定

酶性能测定包括初筛和复筛。初筛是从已分离出来的菌种中挑出包含目的酶的菌株，复筛是在初筛的基础上筛选产酶量高、性能更符合要求的菌株。初筛要求检出方法快速、简便，而复筛则要求测定方法相对精确。

初筛多采用平板培养透明圈法。例如，筛选蛋白酶产生菌，可以用该酶的底物——干酪素作为平板培养基的主要氮源。经过培养，产蛋白酶菌株的菌落周围形成透明的水解圈（clearing或lysis zone），从透明圈的大小可大致判断出菌株的产酶能力。对于脂肪酶产生菌株的筛选，若用橄榄油作碳源底物，有时透明圈不明显，可在培养基中添加若丹明B，则在紫外线照射下，产脂肪酶菌株的菌落周围出现橘黄色荧光圈。另一种方法是以色素的“色原底物”（chromogenic substrate）作为平板培养基的主要碳源或氮源。例如，以对硝基-a-D-葡萄糖苷作为底物筛选a-葡糖苷酶产生菌，如果是a-葡糖苷酶产生菌，那么在它生长繁殖时就会水解其周围的色原底物——对硝基苯-a-D-葡萄糖苷，释放出黄色色素物质——对硝基苯酚，形成澄明透亮的颜色环。

复筛是将初筛出来的产酶能力较强的菌株移入三角瓶内振荡培养，然后用生产上常规测定方法对培养产物进行分析检测，从中找出产酶量高、性能上更符合要求的菌株。由于摇瓶条件和发酵罐条件大致接近，所以测得的结果一般能初步反映产酶菌种的实际生产能力。

4.菌种的选育

通常从自然界中筛选得到的野生型菌株产量都比较低，不能满足生产的需要，因此需要进一步选育高产菌株提高产量。通常有以下方法。(www.xing528.com)

（1）诱变育种。传统的物理和化学诱变育种方法是目前最常用的菌株遗传改造方法。常用物理诱变因子有紫外线、60Co-γ射线、微波诱变等；化学诱变剂有亚硝基胍（NTG）和硫酸二乙酯（DES）等。除了传统诱变方法外，空间诱变、离子注入法、常压室温等离子体诱变也成为一种重要的育种手段。

（2）代谢控制育种。微生物代谢控制育种是指以生物化学和遗传学为基础，研究代谢产物的生物合成途径和代谢调节的机制，选择巧妙的技术路线，通过遗传育种技术获得解除或绕过了微生物正常代谢途径的突变株，从而人为地使有用产物选择性地大量合成积累的菌株选育方案。例如，高产目标酶的营养缺陷性突变株、抗反馈调节突变株、耐毒性突变株等。

（3）原生质体融合育种。原生质体融合技术是起源于20世纪60年代的一项重要的菌种改良技术，是将亲株细胞分别去除细胞壁后进行融合，经基因组间的交换重组，获得融合子的过程。与其他育种技术相比，原生质体融合技术具有重组频率高、受结合型或致育型限制小，以及遗传物质传递完整且不需要完全了解作用机制等优点。

（4）基因工程育种。基因工程是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。在很多酶合成途径过程中，酶合成速度都会受合成途径中关键酶的控制，如能利用基因工程的方法，克隆此关键酶基因，再通过重组DNA技术引入宿主菌，使关键酶基因拷贝数增加并高效表达，从而增强合成目标酶的能力。

（5）基因组改组。基因组改组（genome shuffling）技术是分子定向进化在全基因组水平的延伸。它将重组的对象从单个基因扩展到整个基因组，可以在更广泛的范围内对菌种的多种优良性状进行优化组合。目前，基因组改组技术已广泛应用于微生物菌种选育。对微生物进行基因组改组，首先要通过诱变育种的方法来获得目的性状得到改进的正向突变菌株的基因组库，然后对筛选出的多株正突变菌株进行递推式融合（recursive fusion）。

在生产实践过程中，结合具体情况，灵活选用以上方法，相信能得到高酶产量的菌株。不过，无论使用何种途径，最终都必须从一批突变菌株中快速筛选高产目标菌株，筛选工作量大而繁杂，在选择性培养基中添加适当的筛选因子建立高通量筛选系统，可以大大提高筛选效率。同时，合理结合酶标仪、高效液相色谱（HPLC）和超高效液相色谱（UPLC）等测定分析技术可以进一步提高筛选效率和通量。

（四）菌种扩大培养与退化问题

1.菌种扩大培养

菌种的扩大培养就是把保藏的菌种，即砂土管、甘油管或冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化，再经过茄子瓶和种子罐，逐级扩大培养达到一定的数量和质量的纯种培养过程，这些纯种的培养物称为种子。菌种扩大培养的目的是获得活力旺盛、接种数量足够的培养物。对于不同发酵产品的菌种扩大培养，必须根据菌种生长繁殖速度快慢决定菌种扩大培养的级数。酶制剂发酵生产通常采用三级发酵。

2.种子制备的过程

在种子制备时应注意：防止污染，尽量减少转接次数，如直接由固体斜面菌种接种种子瓶；避免对种子培养基进行长时间高温灭菌，以防止对种子产生不良影响。

菌种扩大培养所使用的培养基和培养条件，应当适合细胞生长、繁殖。种子培养基一般要求含有较丰富的氮源，碳源可以相对少一点。菌种扩大培养时，温度、pH、溶解氧等培养条件应当尽量满足细胞繁殖的需要。菌种扩大培养的时间一般以培养到细胞对数生长期为宜。

3.种子质量的控制

（1）影响种子质量的因素及其控制。

①培养基。培养基的营养成分应适合种子培养的需要，一般选择有利于孢子发芽和菌丝生长的培养基，在营养上易于被菌体直接吸收和利用，营养成分要适当丰富和完全，氮源和维生素含量较高。培养基的营养成分要尽可能和发酵培养基接近，以便种子移入发酵罐后能比较容易适应发酵罐的培养环境。

②培养条件。种子培养应选择最适温度，提高培养温度，可使菌体代谢活动加快，缩短培养时间。培养液的pH要比较稳定，适合菌体的生长和发育。液体深层发酵过程中通气搅拌的控制极其重要，固体发酵在考虑翻曲和通气的同时，需要重视培养物料的湿度控制，其中真菌对湿度要求较高，放线菌对湿度要求较低。

③种龄。工业发酵生产中，一般都选在生命力极为旺盛的对数生长期，培养液的菌体量尚未达到高峰时移种。最适种龄因菌种不同而有很大差异，其中，细菌的种龄一般为7～24h，霉菌种龄一般为16～50h，放线菌种龄一般为21～64h。

④接种量。移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例称为接种量。发酵罐的接种量的大小与菌种特性、种子质量和发酵条件等有关。

⑤种子质量的判断。细菌、酵母菌是单细胞菌体，其种子的质量要求是菌体健壮、菌形一致、均匀整齐，有的还要求有一定的排列和形态。霉菌、放线菌产生菌丝，其种子的质量要求是菌丝粗壮、对某些染料着色力强、生长旺盛、菌丝分枝情况和内含物情况良好。生化指标包括种子液的糖、氮、磷含量的变化和pH的变化。种子质量的判断还包括产物生成量和酶活力等。

⑥种子的异常状况。菌种生长缓慢或过快通常与种子质量和种子罐的培养条件有关。菌丝结团与搅拌效果差、接种量小有关。在种子培养过程中，由于搅拌效果不好，泡沫过多及种子罐装料系数过小等，使菌丝逐步粘在罐壁上，结果使培养液中菌丝浓度减少，最后就可能形成菌丝团。

（2）种子质量的控制措施。

①菌种稳定性检查。少许保藏菌种用无菌生理盐水逐级稀释，稀释度以长成的菌落不至过密为宜，然后涂布稀释培养。挑出形态整齐、丰满的菌落进行摇瓶试验，测定其生产能力，以不低于其原有的生产活力为原则，并取生产能力强的菌种备用。

②无（杂）菌检查。种子制备过程中每移种一步均需进行杂菌检查。方法包括种子液显微镜观察、肉汤或琼脂斜面接入种子液进行无菌试验、种子液的生化分析（营养消耗速度、pH变化、溶解氧利用情况、色泽、气味等）。

4.菌种的退化与复壮

（1）菌种的退化现象。

随着菌种保藏时间的延长或菌种的多次转接传代，菌种本身所具有的优良遗传性状可能得到延续，也可能发生变异。变异有正突变和负突变两种，其中负突变即菌株生产性状的劣化或有些遗传标记的丢失，均称为菌种的退化。常见的菌种退化现象中，最易觉察到的是菌落形态、细胞形态和生理等多方面的改变，如菌落颜色发生改变、畸形细胞的出现、菌株生长变得缓慢，以及菌株产酶能力下降等，所有这些都对发酵生产不利。因此，为了使菌种的优良性状持久延续下去，必须做好菌种的复壮工作，即在菌种的优良性状没有退化之前，定期进行纯种分离和性能测定。

（2）防止退化的措施。

创造合适的培养条件和有效的菌种保藏方法可以达到防止菌种退化的目的。由于微生物容易在繁殖过程中发生突变，控制传代次数能减少突变的发生频率。所以应尽量避免不必要的移种和传代，把必要的传代降低到最低水平，以降低自发突发的概率。这要求不论在实验室还是在生产上，必须严格控制菌种的移种传代次数，并根据菌种保藏方法的不同，确立恰当的移种传代的时间间隔。如同时采用斜面保藏和其他的保藏方式（如真空冻干保藏、砂土管保藏、甘油管保藏、液氮保藏等），以延长菌种保藏时间。

（3）退化菌种的复壮。

退化菌种的复壮可通过纯种分离和性能测定等方法来实现，其中一种方案是从退化菌种的群体中找出少数尚未退化的个体，以达到恢复菌种的原有典型性状。另一种方案是在菌种的生产性能尚未退化前就经常而有意识地进行纯种分离和生产性能的测定工作，以使菌种的生产性能逐步有所提高。

（4）基因工程菌的不稳定性及对策。

基因工程菌携带的外源基因具有存在于染色体上和质粒上两种形式。外源基因整合在染色体上，其遗传性状较为稳定；如果存在于质粒上，由于质粒的不稳定性，在繁殖传代过程中质粒会部分甚至完全丢失，外源基因丢失的可能性大大增加。含有重组质粒基因工程菌的比生长速率往往比受体菌要小。通常而言，低温有利于重组质粒稳定地遗传。

为了保持携带外源基因质粒的基因工程菌产酶的稳定性，常采取以下措施。

①组建合适载体和受体菌。选择能稳定传代的载体和受体菌组合。

②适当施加选择压力。利用某些生长条件，只让那些具有一定遗传特性的细胞生长，如添加抗生素或其他措施。

③诱导表达，控制基因过量表达。由于外源基因表达水平越高，重组菌往往越不稳定。因此一般采用两阶段培养法，即在发酵前期控制外源基因不过量表达，使重组质粒稳定地遗传。在发酵产酶期，通过提高质粒的拷贝数或转录翻译效率，使外源基因高效表达。例如，采用温度敏感型质粒表达β-内酰胺酶，生长前期在30℃时质粒的拷贝数为较少。而后期温度升高到35℃时，质粒拷贝数增加，β-内酰胺酶活力大为提高。