微生物组取样的注意事项与分析方法

在动物的微生物组研究的实验设计中，除了要合理的设计外，还需仔细考虑样本处理过程的影响因素，以及用于分析微生物组数据的生物信息学方法。在大多微生物组的研究中都使用动物粪便作为样本。但需注意的是，粪便中的微生物组不一定能够准确地反映相关部位的微生物组的特征。如小肠的细菌丰度低一些，微生物组成分也没那么复杂；因此，如果小肠的生理功能与其微生物组的关系是研究的重要部分，采用粪便样本就不合适。同样的，从更深层次来讲，小肠的生理功能与肠黏膜层微生物组的关系比肠腔微生物组更密切。对于同一个部位，因为pH、营养水平、胆汁酸、氧含量、相关的免疫细胞和黏液成分等的梯度都会影响局部微生物组的组成和代谢。

取样的时间也很重要，因为在出生后不久肠道内的微生物组会迅速改变，并随着时间的推移逐渐趋于稳定。小鼠的肠道微生物组通常在出生几周后就相当稳定，而人类则需要几年。越是成长早期，微生物组的变异越大。样本的处理和储存条件均会影响微生物组测序结果的准确性。样本最好立即加工或冷冻。冷冻干燥法会略微改变粪便样本的微生物成分（Lewis et al，2016）。不同的DNA提取方法和试剂盒都可能使检测结果产生轻微差异。裂解方法的选择是一个尤为重要的问题，因为裂解效力不同会使结果具有天壤之别。因此最重要的是确保在任一研究中，使用相同的方法提取所有样本的DNA。使用扩增16SrRNA基因的方法对微生物组的差异进行对比分析时，可选择不同的引物对16SrRNA基因的不同区域进行扩增。只有在同一扩增条件下使用相同的引物对相同区域进行扩增，所得结果才具有可比性；对不同可变区域进行测序，所得结果不同。

对原始的DNA序列数据进行加工处理和分析的生物信息学工具和分析方法很多。根据不同的任务可选择不同的软件工具，如删除序列假象、嵌合检查、序列聚类分析、操作分类单元（operational taxon omicunit，OTU）选择和系统分类等。微生物组研究的最终目的通常是通过组间比较发现微生物组成分的变化，而所用分析方法不同，所得出的结果很可能会有轻微差别，有时候甚至会出现明显不同的结果（Westcott et al，2015）。与取样和DNA制备技术一样，下游生物学分析最重要的内容是采用相同的方法将同一研究中的结果标准化，以便数据的收集和分析。(www.xing528.com)

大量的研究采用的是分析16SrRNA序列的方法。这里需要注意的是，一般不能根据16SrRNA基因测序结果从菌株水平上将不同细菌加以分类；它只能区分序列相似的簇，相似度大于97%或95%的序列可组成一个OTU。每一个OTU都由很多种特定菌株组成，因此共享用一个OTU并不代表着它们的特定菌株也是一样的。我们还必须认识到，很多种细菌是高度多样化的，如大肠菌菌株的基因组成有40%多是不一样的，但根据16S测序结果无法确定其不同菌株的基因差异。因此，在解释和报告研究成果时，需注意所用语言的正确性，并对微生物组成分的16SrRNA测序结果的相关信息进行合理解释。