胃肠微生态的有效治疗：FMT和CDI关联

健康人类和动物体内绝大部分（90%～99%）是两类细菌，即厚壁菌门和变形拟杆菌门。C.difficile是远端肠道的共生菌，但其生长繁殖和病原体的活性通常受肠道共生菌群抑制。C.difficile的致病菌株繁殖体分泌肠毒素，破坏小肠黏膜上皮细胞，导致严重的炎症反应及分泌性腹泻。抗生素是CDI最主要的危险因素，抗生素使用的时间越长，罹患CDI的风险越大。反复使用抗生素，会削弱肠道菌群对C.difficile的定植抵抗作用，导致细菌孢子体长期处于抗生素抵抗状态，从而诱发RCDI。但值得注意的是，抗生素的使用也是CDI的标准治疗方案。

RCDI的病人粪便标本中细菌多样性显著降低，其菌群特点是肠杆菌家族的细菌成分比例增加，拟杆菌和厚壁菌比例下降。接受FMT后，RCDI病人肠道紊乱的菌群结构可迅速恢复与正常捐赠者的菌群一样，即拟杆菌和厚壁菌占主导地位，肠杆菌成分比例减少。

TcdA和TcdB是同一基因位点产生的两种C.difficile毒素，它们是具有糖基转移酶活性的大分子蛋白，以三磷酸鸟甘酸Rho、Rac和Cdc42为靶点，降解肌动蛋白。将纯化的毒素作用于动物模型，能模拟出CDI的肠道损伤。C.difficile可产生其他毒素，即二元毒素，NAP1/027/BI为产生这种毒素的代表性C.difficile的亚株。NAP1/027/BI菌株分离出的毒素毒力也逐渐提高。

链霉素可致小鼠肠道菌群的减少，导致宿主对病原菌定植抵抗能力下降，诱发机会菌感染，如大肠埃希菌、肺炎克雷伯杆菌和绿脓杆菌等。肠道菌群介导定植抵抗的潜在机制包括与致病菌竞争营养和生存空间，产生大肠杆菌素及诱导宿主免疫反应等。体外实验可模拟胃肠道的生理学，证明盲肠的微生物群在营养物质碳源竞争中胜过志贺菌属，从而获得定植抵抗的能力。人们还发现共栖类杆菌的代谢产物包括乙酸、丁酸等，能抑制沙门菌的生长，而抗生素的使用能显著影响这些类杆菌的结构和功能。这些研究结果揭示了肠道内抗生素敏感的菌群对病原菌的直接抑制作用。

人类和动物实验均提示抗生素对肠道菌群结构具有长期复杂的影响。肠道菌群结构的改变影响了肠道菌群的功能，从而可能削弱其抵抗CDI的功能。Milani等人通过16SrRNA微生物结构法比较三组病人的肠道菌群结构，25名CDI阳性病人，29名经抗生素治疗但CDI阴性病人，30名CDI阴性且未经抗生素治疗的老年住院病人。研究结果发现，CDI病人肠道菌群的多态性明显降低，保护性菌群表达明显降低，有害菌群表达明显升高（Milani et al，2016）。

最初用来研究C.difficile、菌群和宿主组织之间的关系的模型是CDI叙利亚仓鼠模型，但现在小鼠的模型越来越多。在仓鼠的CDI模型中，克林霉素是使宿主产生易感性的标准抗生素。CDI仓鼠经克林霉素治疗后，肠道菌群可达到一个新稳态，但不能恢复至最初的状态。2008年Chen在小鼠模型中预先使用5种混合的抗生素，接着单用克林霉素，发现这样可增加小鼠对CDI的易感性，继而发展成重度结肠炎（Chen et al，2008）。后来又一项研究使用同一种动物模型，给予小鼠卡那霉素、庆大霉素、黏菌素、甲硝唑和万古霉素五种混合抗生素饮用3天后，单剂量克林霉素腹膜内注射或口服10天的头孢哌酮处理后，鼻饲105克隆量的C.difficile菌株VPI10463，结果显示发生严重肠炎的小鼠肠道菌群结构明显不同，变形菌门增加明显，尤其是大肠杆菌，而在预后良好小鼠体内的厚壁菌门明显增加，毛螺旋菌科明显增多。疾病的严重程度与这些菌群的比例相关，如毛螺旋菌科减少而大肠杆菌持续占主导地位，且疾病预后差。小鼠模型模拟了CDI的发病过程：一方面，C.difficile的扩散及毒素的产生；另一方面，肠道菌群在受抗生素干扰后，有向基础状态恢复的趋势。混合抗生素和克林霉素处理的动物，罹患CDI后死亡率约为50%，反映了两方面的平衡，如果病原菌生长及产生毒素的速度大于肠道菌群结构和功能的恢复，则临床上预后差。相反，如果菌群的恢复先于C.difficile的侵袭，则能控制感染。观察某种属细菌在抑制定植方面的作用，一般是通过每种属代表细菌单独定植于无菌小鼠中完成。大肠杆菌本身对C.difficile的定植没有显著的影响，也不会导致肠炎，然而，毛螺旋菌科能显著降低C.difficile的定植水平及降低结肠炎的严重程度。在小鼠疾病模型中，许多种抗生素如喹诺酮类、头孢菌素类、氨基青霉素类等都能导致肠道菌群对C.difficile定植抗力的缺失。(www.xing528.com)

有关针对CDI病人肠道菌群的研究，提供的信息与动物实验研究结果一致。如健康志愿者使用抗生素环丙沙星，人类肠道菌群的多样性降低，但4周内能够恢复至治疗前状态。高龄是CDI已知的另一危险因素。健康的肠道菌群长期保持稳定，然而老年人的肠道菌群多样化减少。以老年志愿者作为研究对象的队列研究发现，保护性菌属如双歧杆菌和一些厚壁菌门降低，而有害菌属增多，这些改变部分和老年人衰退的免疫系统相关，称为免疫衰老。由此，就不难解释为何大于65岁的人群的CDI患病率高。随年龄增长，抗生素使用增多，住院的次数增多等都能提高机体对C.difficile的易感性。抗生素能改变肠道菌群的结构，那些使用抗生素后的CDI病人的粪便标本菌群的多样性较非CDI的病人低。RCDI病人的肠道菌群多样性较那些非CDI的病人或治疗有效未再复发的病人少。首发或RCDI病人粪便细菌的成分不同于那些无症状而有细菌定植的人群，这些发现解释了为什么粪便移植在治疗顽固的CDI是有效的。

抗生素治疗能减少碳水化合物的厌氧发酵，降低短链脂肪酸（SCFA）的生成。SCFA也会影响定植抵抗。如使用SCFA尤其是丁酸盐喂养猪，可降低动物肠内pH，抑制C.difficile的定植。在体外，相当于豚鼠盲肠浓度的SCFA可抑制艰难梭菌的生长。抗生素可能通过改变肠道菌群，降低了肠道SCFA的水平，从而导致C.difficile定植。有初步的证据表明质子泵抑制剂的使用和CDI风险增高相关。SCFA尤其是丁二酸（肠道上皮细胞的主要能量物质）能通过降低肠道通透性而维持上皮完整。FMT能提高粪便菌群多样性，尤其是丁二酸生成菌Lachnospiraceae比例升高。这些发现证实了Lachnospiraceae是FMT成功的关键菌，同时证实了SCFA在CDI定植抵抗中的作用（Dutta et al，2014）。明确CDI感染前后的肠道内代谢变化，这对于肠道菌群对C.difficile的定植抵抗机制研究具有很重要的意义。

某些肠道微生物可能通过生成各种噬菌体、小分子或者杀菌多肽（细菌素），抑制C.difficile生长或者直接抑制其毒素的活性。例如乳酸菌属保加利亚乳酸菌产生的B-30892抑制C.difficile对肠上皮细胞的附着和毒性，但其并不影响C.difficile的繁殖生长。此外，thuricin CD菌分泌的细菌毒素在体外能抑制C.difficile。在使用甲硝唑和万古霉素治疗病人时，这种菌的比例明显占优势。

肠道微生物菌群通过与宿主作用，间接干扰C.difficile的生命周期。结肠细菌参与宿主胆汁酸的代谢，从而影响了C.difficile的生长发育。细菌介导初级胆汁酸的降解、7α-脱羧基等反应生成次级胆汁酸、脱氧胆酸盐和游离石胆酸。牛磺胆酸盐是一个主要的初级胆汁酸，可促进C.difficile孢子出芽，与此相反，游离石胆酸能抑制C.difficile孢子出芽。脱氧胆酸能抑制C.difficile的繁殖体生长。抗生素可致微生物群发生改变，进而改变胆汁成分。FMT可使病人的粪便的胆汁酸成分迅速恢复与捐赠者相似。克林霉素处理的小鼠的小肠和盲肠的提取物中含有相对高浓度的初级胆汁酸盐，可刺激C.difficile的孢子出芽和繁殖体形成。有些C.difficile的突变体不能表达胆汁刺激出芽所必需的受体，从而致病能力较低。胆汁酸盐可结合胆盐琼脂和考来希胺散阴离子交换树脂，中和出芽所需的活性因子，使C.difficile的活性受到抑制。临床实验中，RCDI的粪便标本中初级胆汁酸盐浓度增加，但几乎检测不到次级胆汁酸盐。有报道考来希胺散能成功治疗RCDI，但考来希胺散治疗初发型CDI无效，这种区别可能是考来希胺散刺激胆汁酸的合成，且结合万古霉素所致。

微生物也可通过影响宿主的免疫机制阻止C.difficile的定植。使用抗生素后，小鼠体内Toll受体信号转导下降，小鼠对病原菌的易感性增加。MyD88是大多数Toll受体信号转导所需的蛋白分子。有研究表明，MyD88的缺乏可导致小鼠易感性增加。TLR4-/-的小鼠较TriF-/-、TLR2-/-或TLR5-/-小鼠罹患CDI时病情更重，可能因其不产生抵抗C.difficile的抗体所致。RCDI病人体内C.difficile毒素抗体水平较那些无复发的病人更低。人类TLR4信号通路的基因多态性与医院获得性CDI的风险相关。虽然TLR4信号通路通常是由革兰阴性菌的脂多糖激活，但C.difficile的表层蛋白质也可通过此通路影响宿主。细菌刺激TLR，介导宿主的天然免疫和获得性免疫反应，也能参与C.difficile的免疫调节作用。肠道沙门菌的鞭毛蛋白能通过刺激TLR5信号通路治疗结肠炎，其不仅可抑制C.difficile的播散，且能减少上皮细胞的凋亡。宿主的潘氏细胞表达的α-防御素（一种抗菌肽），也通过MyD88和TLR信号通路转导，可中和C.difficile产生的毒素B，从而保护宿主抵御CDI。