自噬发生是一个动态的过程，可以通过自噬流的形成来判断，自噬流包括自噬膜生成、自噬体形成、自噬体溶酶体形成，以及溶酶体降解自噬体内待降解物质等环节。在这些环节中蛋白微管相关蛋白1 轻链3（microtubuleassociatedprotein 1 light chain 3，LC3/Atg8）是评价自噬的重要指标，LC3 蛋白在细胞内以LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ两种形式存在。当LC3 蛋白在合成后其C端被Atg4 蛋白酶切割变成LC3-Ⅰ，分布于细胞质内。自噬体形成过程中，LC3-Ⅰ和磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）偶联形成LC3-Ⅱ，自噬体内膜和外膜均有LC3-Ⅱ蛋白稳定存在，因此可被用来作为自噬体的标记，且LC3-Ⅱ/Ⅰ的水平可以反映自噬水平。有报道称，生理诱导自噬或通过雷帕霉素刺激均能导致分枝杆菌吞噬体与自噬效应物LC3 上调。本课题组试验结果表明（如图7-4），BCG 感染后巨噬细胞内LC3Ⅱ/Ⅰ的表达量均高于对照组，感染6 h 后LC3Ⅱ/Ⅰ的表达量显著上调，感染12 h 后LC3Ⅱ/Ⅰ的表达量极显著上调，感染18 h 和24 h LC3Ⅱ/Ⅰ的表达量均低于12 h。因此，BCG 感染后上调巨噬细胞内LC3Ⅱ/Ⅰ的表达，且在感染12 h 后LC3Ⅱ/Ⅰ的表达量最高。除此之外，在相同感染时间内用不同感染复数的BCG 感染巨噬细胞后发现，当感染复数为10 时，巨噬细胞内LC3Ⅱ/Ⅰ的表达量极显著高于对照组。结合其他科学家的研究，可以肯定的是，结核分枝杆菌可以诱导巨噬细胞发生自噬。这可能是细胞面对病原菌入侵做出的相应反应。从一些结果也看到，细胞死亡也是存在的，但是这到底是自噬性死亡还是坏死还有待于进一步研究。
图7-4 BCG 感染对巨噬细胞RAW264.7 细胞LC3 蛋白表达的影响
随着科学技术的发展，判断自噬流还有一种更为直观的方法，那就是可采用mRFP-GFP-LC3A/B 串联荧光蛋白腺病毒来感染细胞，并以自噬体和自噬溶酶体的数量来判断自噬流形成和自噬的发生。其原理主要是由于GFP 是酸敏感型蛋白会受细胞内pH 值的影响，而mRFP 是稳定的荧光表达基团，不受外界条件影响。当自噬体与溶酶体进行融合，形成自噬溶酶体。自噬溶酶体由于溶酶体内部的酸性环境，导致pH 值下降，GFP 荧光淬灭，而GFP 的减弱可指示形成自噬溶酶体的顺利程度，GFP 越少，表明从自噬小体到自噬溶酶体阶段流通得越顺畅。反之，自噬小体和溶酶体融合被抑制，自噬溶酶体形成过程受阻。因此，可以通过GFP 与mRFP 的亮点比例来评价自噬流进程。但是，绿色荧光淬灭主要依赖于GFP 对pH 值的敏感性，如果GFP 对酸性条件的敏感性不高也可能造成自噬结果的误判，因此，自噬流是否顺畅还要结合LC3II/ LC3I 的表达比例和P62 等蛋白的表达量一起来判定。(www.xing528.com)
当LC3 II 升高，P62 同时降低，表明自噬流通畅；如果LC3II 升高，P62升高，表明自噬起始正常，但下游不通畅，这可能是P62 的积累阶段使吞噬体和溶酶体不能融合。和其他病原菌一样，结核分枝杆菌疫苗株BCG 感染后能诱导细胞发生自噬，使细胞内的自噬体（黄色斑点）和自噬溶酶体（红色斑点）数量均高于健康细胞（图7-5），由此可以看出，结核分枝杆菌感染可以诱导自噬溶酶体和自噬体的形成。但是，图中结果同时显示绿色荧光斑点并没有减少，这可能主要是由于mRFP-GFP-LC3A/B 串联荧光蛋白腺病毒中GFP 对pH 值的敏感性不高所致，关于这类问题，Edward T. W. Bampton 等人也给出了相似的结论以及解释。
图7-5 BCG 感染后巨噬细胞自噬体和自噬溶酶体数量
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