Wnt经典信号调控炎性反应及结核分枝杆菌感染的免疫机制

炎症作为先天免疫的重要组成部分，能抑制病原菌对机体的感染。此过程受到多条信号通路的严密调控，从而达到既能杀灭病原菌，又不至于引起组织的过度损伤。近年来研究发现，在细菌感染过程中，Wnt 经典信号通路通过与NF-κB 信号通路相互作用调控了炎症分子的表达。最初在结肠癌和乳腺癌的研究中发现，β-catenin 通过与RelA 和p50 形成复合体，从而减弱了NFκB 的DNA 的结合能力和转录调控能力，进而抑制了NF-κB 信号途径的下游基因Fas 的表达和外源性细胞凋亡的激活。进一步研究发现，β-catenin 与NF-κB 通过与多种其他蛋白的协助产生间接相互作用，在这一过程中除了RelA 还需要PI3K 的参与，通过抑制剂下调PI3K 的表达会解除β-catenin 对NF-κB 的抑制作用。此外在细菌或病毒感染模型的研究中发现，Wnt 经典信号通路的激活会抑制NF-κB 介导的炎性信号的激活。GSK-3β 能抑制Wnt 经典信号的激活，而过表达β-catenin 或GSK-3β 抑制剂处理能激活Wnt 信号途径，并抑制LPS 诱导的炎性因子IL6、IL8 和TNF-α 的表达。在针对βcatenin 敲除鼠的研究中发现，相较于正常小鼠，敲除鼠在受到LPS 刺激后NF-κB 信号通路更加活跃。然而，也有研究表明Wnt 经典信号途径对NF-κB 的激活有积极作用。βTrCP 是由BTRC 基因编导的E3 泛素连接酶，能够靶向泛素化并降解β-catenin 和IκB-α。BTRC 基因是Wnt 经典信号途径的下游基因之一，在平滑肌细胞的研究中发现，Wnt1 能促进βTrCP 的表达，βTrCP 随后降解β-catenin 蛋白以负反馈的方式抑制Wnt 经典信号的持续激活。同时βTrCP 也降解了NF-κB 的抑制亚基IκB-α，从而促进了NF-κB 信号的激活。

综上可见Wnt 经典信号途径和NF-κB 的相互作用复杂，且有组织和刺激依赖性。大量研究证实，在LPS 处理、细胞因子刺激（IL-1β 等）、病毒和细菌感染过程中，Wnt 经典信号途径的激活能抑制炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-α 的释放。而在APC 敲除鼠的研究中发现，β-catenin 蛋白通过直接诱导转录或间接与NF-κB 途径相互作用，诱导肝细胞的炎症反应。但在此过程中，β-catenin 只激活了趋化因子的表达，并未诱导典型促炎细胞因子的表达，说明β-catenin 信号可能通过改变细胞微环境间接促进肿瘤相关的炎症反应。

Mtb 主要经过呼吸道感染宿主。吸入肺内的Mtb，经巨噬细胞表面的模式识别受体介导吞噬。Mtb 抗原成分可刺激巨噬细胞产生TNF-α、IL-12、IL-6 和各种趋化因子，这些炎性因子募集到病变部位，产生炎性反应。Mtb 还能刺激机体产生一系列复杂的抗结核免疫相关细胞因子和趋化因子间的相互作用网络，促炎因子TNF-α 和IL-6 以及抑炎因子IL-10 等是这一网络的关键调控因子。

为了评估Wnt 经典信号通路对结核分枝杆菌感染后巨噬细胞释放前炎性因子调控作用，我们通过Real-time PCR 及ELISA 方法检测激活和阻断Wnt /β-catenin 信号通路后BCG 感染的巨噬细胞的促炎因子IL-6、TNF-α和抑炎因子IL-10 的表达水平。结果如图4-3、4-4 所示，BCG 刺激后IL-6和TNF-α 的mRNA 及蛋白水平均极显著升高，而Wnt3a 则抑制了BCG 刺激后二者的表达水平，DKK1 能有效抑制Wnt3a 对Wnt 经典信号通路的激活效果。这与其他小组的研究报道结果是一致的。同时Wnt3a 还上调了BCG感染后巨噬细胞的抑炎因子IL-10 的mRNA 水平。以上结果表明，激活Wnt经典信号通路对结核分枝杆菌感染后巨噬细胞的炎性反应具有负调控作用。在机体维持炎性平衡，防止结核分枝杆菌感染后由于机体过度炎性反应导致细胞或组织坏死具有积极意义。

图4-3　巨噬细胞IL-6 和IL-10 表达水平(www.xing528.com)

图4-4　RAW264.7 细胞TNF-α 的蛋白及mRNA 表达水平

通过检测相关炎性因子的mRNA 及蛋白水平，研究发现，BCG 刺激后IL-6 和TNF-α 的mRNA 及蛋白水平均极显著升高，而Wnt3a 则有效抑制了BCG 刺激后IL-6 和TNF-α 的表达水平。这与其他实验室的研究结果相似，同时Wnt3a 上调BCG 感染后巨噬细胞的抑炎因子IL-10 的mRNA 水平。IL-10 可以由巨噬细胞分泌，与TNF-a 起完全相反的作用，是一种抗炎症因子。而其他实验室研究证实，IL-10 抑制巨噬细胞释放炎性因子，阻止抗原递呈，使用lL-10 抗体封闭了IL-10 功能以后，可以看到TNF-a 和IL-1β 的含量显著增加。这表明激活Wnt 经典信号通路对细胞炎性反应具有负调控作用，而且在结核分枝杆菌感染后巨噬细胞维持炎性平衡，防止细胞或组织坏死方面将具有重要作用。

以往研究证实，在结核分枝杆菌感染细胞后，培养细胞上清液内TNF-α的含量会明显上升，而缺乏TNF-α 和TNF-α 受体（TNFR）的小鼠对于结核感染的易感性增加，且生成肉芽肿的能力受损。而BCG 可以诱导单核细胞释放TNF-α，抑制单核细胞释放IL-10。产生的TNF-α 又可以参与宿主对Mtb的应答反应，这种应答在激活宿主的保护反应并能清除Mtb，这也为Mtb 提供了潜伏的场所，由此可以看出，TNF-α 对机体既有保护作用也有不利影响。通过我们的研究发现，BCG 刺激后IL-6 和TNF-α 的mRNA 及蛋白水平均极显著升高，而Wnt3a 则有效抑制了BCG 刺激后IL-6 和TNF-α 的表达水平。这与其他研究小组报道的研究结果相似。同时Wnt3a 上调BCG 感染后巨噬细胞的抑炎因子IL-10 的mRNA 水平。IL-10 主要由巨噬细胞分泌，是一种抗炎因子，可以抑制巨噬细胞释放炎性因子，阻止抗原递呈作用。这表明激活Wnt 经典信号通路对结核分枝杆菌感染后巨噬细胞维持机体内环境稳定，防止结核分枝杆菌感染后由于机体过度炎性反应导致细胞或组织坏死具有积极意义。