Wnt经典信号及NF-κB在结核分枝杆菌感染中的免疫调控

结核分枝杆菌感染巨噬细胞后可通过激活TLR-NFκB 信号通路诱发免疫反应。结核分枝杆菌首先和巨噬细胞等细胞膜上的一系列模式受体结合，从而触发TLR-NFκB 信号通路。TLRs 是一类重要的先天性模式识别受体，它们最突出的生物学功能是促进细胞因子的合成与释放，引发炎症反应，它们通过识别细菌的保守结构，在天然免疫反应中发挥重要作用。TLRs有两条主要的信号转导通路。一条是髓样分化因子88（Myeloid differentiation factor 88，MyD88）依赖的信号通路，当TLRs 被激活时，其下游分子：髓样分化因子、IL-1R 相关的激酶（IL-1R-associated kinase IRAK）和肿瘤坏死因子相关因子6（TNFR-associated factor 6 TRAF6）等活化后，可以进一步激活核转录因子NF-NFκB（nuclear transcrip -tion factor KappaB，NFκB）诱导激酶（NFκB inducing kinase NIK）使NFκB 活化，被激活的NFκB 将启动各种炎症细胞因子基因的转录，引起一系列免疫和炎症反应，已有证据指出，TLR-2 的过度表达可导致过激的炎症反应，引发感染性休克。因为Wnt 信号对TLRNFκB 途径具有调节作用，从而发挥了Wnt 信号对细胞先天免疫的促进作用，另据李勇等2014年报道，β-catenin 对BCG 感染后的肺脏上皮细胞A549 的NFκB 具有下调作用，从而抑制NFκB 介导的炎性因子的过度分泌。

OctavioSilva-García 等人指出，Wnt 经典信号通路的基因是包括结核分枝杆菌在内的多种致病菌的分子靶标。相关文献记载，在小鼠模型中，当细胞被结核分枝杆菌感染后，经典Wnt 途径代表Wnt3a 的下调可预防结核感染，而非经典途径代表Wnt5a 的下调以及Wnt6 的上调则促进结核分枝杆菌的感染。除此以外，Wnt3a、Wnt5a 和Wnt6 还可抑制TNF-α、IL-12 和IFN-γ的产生及细胞坏死。我们的前期研究结果也表明，经典Wnt 信号途径的激活可以通过ROS 介导的PARP1-AIF 信号通路抑制BCG 诱导的巨噬细胞坏死。同时，激活Wnt 经典信号传导还可以通过caspase 依赖性凋亡途径促进BCG 感染巨噬细胞的凋亡，以及Wnt /β-catenin 信号传导可能会通过激活mTOR 依赖性途径抑制BCG 感染巨噬细胞的自噬。由此我们可以推断，NFκB 与凋亡、坏死、自噬等程序性细胞死亡方式相关。这也表明结核分枝杆菌感染巨噬细胞激活Wnt 信号通路的同时必然会参与NF-κB 介导的多种生物学效应。

因此，为了了解Wnt 经典信号通路激活后对小鼠巨噬细胞TLR-NFκB信号通路的影响，本课题组检测了结核分枝杆菌疫苗株BCG 感染后巨噬细胞中TLR2、MyD88 和TRAF6 的mRNA 及NFκB 的mRNA 和蛋白表达水平。由图3-3、图3-4 可知，BCG 可显著上调TLR2 和TRAF6 的mRNA 水平，而Wnt3a 则显著下调了BCG 感染后的巨噬细胞的TLR2 和TRAF6 的表达水平。在BCG 刺激情况下Wnt3a 对MyD88 的mRNA 水平具有显著下调的作用，虽然Wnt3a 上调了NFκB 的mRNA 和蛋白水平，但是其对BCG 感染后的巨噬细胞NFκB 的mRNA 和蛋白水平有显著下调的作用（图3-5、图3-6）。而Wnt 经典信号的抑制剂DKK1 则有效抑制了Wnt /β-catenin 信号对这几种基因表达的调控效果。因为NFκB 在炎症反应调控中起核心作用，是炎症信号通路的最终会合点，所以根据我们的研究结果Wnt /β-catenin 信号通路对BCG 感染后巨噬细胞NFκB 表达的下调在机体维持炎性平衡方面发挥了重要作用。

图3-3　RAW264.7 细胞TLR2 mRNA 表达水平

图3-4　RAW264.7 细胞TRAF6 的mRNA 和蛋白表达水平(www.xing528.com)

图3-5　RAW264.7 细胞myD88 的mRNA 表达水平

图3-6　RAW264.7 细胞NF-κB 的mRNA 和蛋白表达水平

在目前的研究中，有研究者观察到结核分枝杆菌气溶胶感染小鼠后TLR、NF-κB 和Wnt /β-catenin 通路相互调节。并且在感染过程中发现Fzd1的mRNA 水平明显上调，这主要取决于TLR、MyD88 和功能性NF-κB 途径的激活。在最近的一项研究中，Schaale 及其同事表明，Wnt6 在感染了结核分枝杆菌的小鼠肺肉芽肿性病变中表达，确定Wnt6 主要来源于感染肺中的泡沫巨噬细胞样细胞，同时在骨髓来源的巨噬细胞中观察到Wnt6 mRNA 的表达并不依赖TNF-α，而是依赖于TLR-MyD88-NF-κB 依赖性诱导模式。同时，结核分枝杆菌依赖的Wnt5a 的正常表达不仅需要TLR2 信号传导而且NF-κB 信号通路的激活也非常重要。这是由于Wnt5a 不仅在巨噬细胞中通过诱导其受体Frizzled 表达，还通过Wnt 经典信号通路发挥对结核分枝杆菌感染巨噬细胞的抗炎作用。当然在这一过程中还涉及了抑制NF-κB 依赖性调节剂GSK3β 的活性。以上实验进一步支持了TLR/NF-κB 和Wnt 信号在功能上相互联系的观点，但是要探明Wnt 经典与NF-κB 的相互作用及二者对病原菌感染后机体的免疫调控机制，未来还要进一步进行研究和探索。