5.1.4.1 百子莲EC线粒体的提取
百子莲EC线粒体的提取采用百浩生物科技有限公司生产的植物线粒体提取试剂盒，参考试剂盒说明书略有改动进行操作。
（1）取百子莲胚性愈伤组织2 g，液氮研磨，加入1.5 m L预冷的Lysis Buffer/β-巯基乙醇溶液，混匀。
（2）将研磨混合物放于2 m L离心管，4℃，1 000 g离心5 min。
（3）将上清转移到新的离心管中，在沉淀中加入0.5 m L Lysis Buffer/β-巯基乙醇溶液，混匀，再次4℃，1 000 g离心5 min，取上清。
（4）合并两次上清，将上清4℃1 000 g再次离心5 min。
（5）取上清，加入一新的离心管中，4℃，16 000 g离心10 min，线粒体沉淀在管底。
（6）在线粒体沉淀中加入0.5 m L Wash Buffer重悬线粒体沉淀，4℃，1 000 g离心5 min。
（7）取上清，加入一新的离心管中，4℃，16 000 g离心10 min。弃上清，高纯度的线粒体沉淀在管底。
（8）用100μL Store Buffer重悬线粒体沉淀，-80℃保存。
5.1.4.2 线粒体蛋白含量的测定
标准曲线的制作：
将56.3 g/L 蛋白标准品用双蒸水稀释成不同浓度：2 500、1 000、500、250、100、50、25、0μg/m L，进行表5-1的操作。
表5-1 蛋白定量标准曲线制作的操作步骤
涡旋混匀，静置5 min，562 nm波长，0.5 cm光径，双蒸水调零，测定各管吸光度值。
线粒体蛋白含量测定采用南京建成生物工程研究所生产的蛋白定量（BCA法）测试盒，参考测试盒说明书略有改动进行操作，具体操作步骤如表5-2所示。
表5-2 蛋白定量（BCA法）测试盒操作步骤
涡旋混匀，静置5 min，562 nm波长，0.5 cm光径，双蒸水调零，测定各管吸光度值。
计算公式：
总蛋白浓度（μg/m L）=
×标准品浓度（536 μg/m L）×样本测定前稀释倍数
5.1.4.3 线粒体电子传递链复合物I活性定量检测
线粒体电子传递链复合物I（NADH-辅酶Q还原酶）测定采用南京建成生物工程研究所生产的线粒体呼吸链复合物I活性比色法定量检测试剂盒，参考测试盒说明书略有改动进行操作。
1）测定准备
设定好双波长分光光度仪（温度为30℃）：波长分别为340 nm和380 nm，间隔30 s，读数7次（共3 min），并置零。
2）背景对照测定
移取780μL缓冲液（Reagent A）到新的比色皿，加入100μL反应液（Reagent B），加入20μL底物液（Reagent D），放进30℃培养箱里静置3 min；加入100μL阴性液（Reagent C），上下倾倒数次，混匀（限定在3 s之内），即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：
（340波长读数-380波长读数）0 min-（340波长读数-380波长读数）1 min或3 min
3）样品总活性测定
移取780μL缓冲液（Reagent A）到新的比色皿，加入100μL反应液（Reagent B），加入20μL底物液（Reagent D），放进30℃培养箱里静置3 min；加入100μL待测样品（10μg总线粒体蛋白），上下倾倒数次，混匀（限定在3 s之内），即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数：（340波长读数-380波长读数）0 min-（340波长读数-380波长读数）1 min或3 min
4）样品非特异活性测定
移取760μL缓冲液（Reagent A）到新的比色皿，加入100μL反应液（Reagent B），加入20μL专性液（Reagent E），加入20μL底物液（Reagent D），放进30℃培养箱里静置3 min；加入100μL待测样品（10μg总线粒体蛋白），上下倾倒数次，混匀（限定在3 s之内），即刻放进分光光度仪检测，此为样品非特异活性读数：（340波长读数-380波长读数）0 min-（340波长读数-380波长读数）1 min或3 min
5）计算样品活性
样品活性（总活性或非特异活性）：
[（样品读数-背景读数）×1（体系容量；m L）×样品稀释倍数]÷[0.1（样品容量；m L）×5.5（毫摩尔吸光系数）×1或3（反应时间；min）]=U/m L÷（样品蛋白浓度）mg/m L=U/mg
U=μmol NADH/min
样品特异活性：
样品总活性-样品非特异活性=样品特异活性
5.1.4.4 线粒体电子传递链复合物II活性定量检测
线粒体电子传递链复合物II（琥珀酸-辅酶Q还原酶）测定采用南京建成生物工程研究所生产的线粒体呼吸链复合物II活性比色法定量检测试剂盒，参考测试盒说明书略有改动进行操作。
1）测定准备
设定好分光光度仪（温度为30℃）：波长为600 nm，间隔60 s，读数6次（共5 min），并置零。
2）背景对照测定
移取780μL缓冲液（Reagent A）到新的比色皿，加入100μL反应液（Reagent B），加入20μL底物液（Reagent D），上下倾倒数次，混匀，放进30℃培养箱里静置3 min；加入100μL阴性液（Reagent C），上下倾倒数次，混匀（限定在3 s之内），即刻放入分光光度仪检测，此为背景空对照：
600波长读数0 min-600波长读数1 min或5 min
3）样品活性测定
移取780μL缓冲液（Reagent A）到新的比色皿，加入100μL反应液（Reagent B），加入20μL底物液（Reagent D），上下倾倒数次，混匀，放进30℃培养箱里静置3 min；加入100μL待测样品（10μg总线粒体蛋白），上下倾倒数次，混匀（限定在3 s之内），即刻放入分光光度仪检测，此为样品活性读数：
600波长读数0 min-600波长读数1 min或5 min
4）计算样品活性
[（样品读数-背景读数）×1（体系容量；m L）×样品稀释倍数]÷[0.1（样品容量；m L）×21.8（毫摩尔吸光系数）×1或5（反应时间；min）]=U/m L÷（样品蛋白浓度）mg/m L=U/mg
U=μmol二氯酚靛酚/min
5.1.4.5 线粒体电子传递链复合物III活性定量检测(www.xing528.com)
线粒体电子传递链复合物III（辅酶Q-细胞色素C还原酶）测定采用南京建成生物工程研究所生产的线粒体呼吸链复合物III活性比色法定量检测试剂盒，参考测试盒说明书略有改动进行操作。
1）测定准备
设定好分光光度仪（温度为30℃）：波长为550 nm，间隔60 s，读数3次（共2 min），并置零。
实验开始前，将-20℃冰箱里的试剂盒中稳定液B（Reagent F2）置于冰槽里融化，然后移出1 m L到稳定液A（Reagent F1）管里，混匀后，标记为稳定工作液，置于冰槽里备用（15 min内用完）。然后将-20℃冰箱里试剂盒中反应液（Reagent B）室温下融化，然后移取10μL到1.5 m L离心管，加入10μL稳定工作液，轻柔混匀后，室温下避光静置15 min（可见颜色变白），标记为反应工作液，然后即可进行下列操作。
2）背景对照测定
移取870μL缓冲液（Reagent A）到新的比色皿，加入10μL反应工作液，加入20μL底物液（Reagent D），室温下静置10 min，避免光照；加入100μL阴性液（Reagent C），上下倾倒数次，混匀（限定在3 s之内），即刻放入分光光度仪检测，此为背景空对照：
550波长读数1 min或2 min-550波长读数0 min
3）样品总活性测定
移取870μL缓冲液（Reagent A）到新的比色皿，加入10μL反应工作液，加入20μL底物液（Reagent D），室温下静置10 min，避免光照；加入100 μL待测样品（10μg总线粒体蛋白），上下倾倒数次，混匀（限定在3 s之内），即刻放入分光光度仪检测，此为样品总活性读数：
550波长读数1 min或2 min-550波长读数0 min
4）样品非特异活性测定
移取850μL缓冲液（Reagent A）到新的比色皿，加入10μL反应工作液，避免光照，加入20μL底物液（Reagent D），室温下静置10 min，避免光照；加入20μL专性液（Reagent E），加入100μL待测样品（10μg总线粒体蛋白），上下倾倒数次，混匀（限定在3 s之内），即刻放入分光光度仪检测，此为样品非特异活性读数：
550波长读数1 min或2 min-550波长读数0 min
5）计算样品活性
样品活性（总活性和非特异活性）：
[（样品读数-背景读数）×1（体系容量；m L）×样品稀释倍数]÷[0.1（样品容量；m L）×21.84（毫摩尔消光系数）×1或2（反应时间；min）]=U/m L÷（样品蛋白浓度）mg/m L=U/mg
U=μmol CoQH2（还原型泛醌）/min
样品特异活性：
样品总活性-样品非特异活性=样品特异活性
5.1.4.6 线粒体电子传递链复合物IV活性定量检测
线粒体电子传递链复合物IV（细胞色素C-氧化还原酶）测定采用南京建成生物工程研究所生产的线粒体呼吸链复合物IV活性比色法定量检测试剂盒，参考测试盒说明书略有改动进行操作。
1）测定准备
设定好分光光度仪：温度25℃，波长550 nm，间隔10 s，测读3次（共20 s），并置零或设置0 s和20 s各测读3次。
2）背景对照测定
移取850μL缓冲液（Reagent A）到新的1 m L比色皿，加入100μL稀释液（Reagent C），上下倾倒数次，混匀，室温下孵育3 min；加入50μL含有反应液（Reagent B）和稳定液（Reagent D）的反应工作液，上下倾倒数次，混匀，即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照（0 s读数-20 s读数）。
3）样品测定
移取850μL缓冲液（Reagent A）到新的比色皿，加入100μL待测样品（2μg线粒体蛋白），上下倾倒数次，混匀，室温下孵育3 min；加入50μL含有反应液（Reagent B）和稳定液（Reagent D）的反应工作液，即刻上下倾倒数次，混匀（限定在3 s之内），即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数（0 s读数-20 s读数）。
4）计算样品活性
[（样品读数-背景读数）×1（体系容量；m L）×样品稀释倍数]÷[0.1（样品容量；m L）×21.84（毫摩尔吸光系数×1（反应时间；min）]=U/m L÷（样品蛋白浓度）mg/m L=U/mg
U=μmol细胞色素C/min
5.1.4.7 线粒体电子传递链复合物V活性定量检测
线粒体电子传递链复合物V（F0F1-ATP酶/ATP合成酶）测定采用南京建成生物工程研究所生产的线粒体呼吸链复合物V活性比色法定量检测试剂盒，参考测试盒说明书略有改动进行操作。
1）测定准备
设定好分光光度仪（温度为30℃）：波长为340 nm，间隔30 s，读数11次（共5 min），并置零。
2）背景对照测定
移取780μL缓冲液（Reagent A）到新的比色皿，加入100μL反应液（Reagent B），加入20μL底物液（Reagent D），放进30℃培养箱里孵育3 min；加入100μL阴性液（Reagent C），上下倾倒数次，混匀（限定在3 s之内），即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：
340波长读数0 min- 340波长读数1 min或5 min
3）样品总活性测定
移取780μL缓冲液（Reagent A）到新的比色皿，加入100μL反应液（Reagent B），加入20μL底物液（Reagent D），放进30℃培养箱里孵育3 min；加入100μL待测样品（10μg总线粒体蛋白），上下倾倒数次，混匀（限定在3 s之内），即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数：
340波长读数0 min- 340波长读数1 min或5 min
4）样品非特异活性测定
实验开始前，移取100μL待测样品（10μg总线粒体蛋白）到1.5 m L离心管，加入20μL专性液（Reagent E），混匀后，放进30℃培养箱里孵育15 min。然后置于冰槽里备用。
移取760μL缓冲液（Reagent A）到新的比色皿，加入100μL反应液（Reagent B），加入20μL底物液（Reagent D），放进30℃培养箱里孵育3 min；加入120μL上述预处理的待测样品，上下倾倒数次，混匀（限定在3 s之内），即刻放进分光光度仪检测，此为样品非特异活性读数：
340波长读数0 min- 340波长读数1 min或5 min
5）计算样品活性
样品活性（总活性和非特异活性）：
[（样品读数-背景读数）×1（体系容量；m L）×样品稀释倍数]÷[0.1（样品容量；m L）×6.22（毫摩尔吸光系数）×1或5（反应时间；min）]=U/m L÷（样品蛋白浓度）mg/m L=U/mg
U=μmol NADH/min
样品特异活性：
样品总活性测定-样品非特异活性测定=样品特异活性
5.1.4.8 线粒体电子传递链相关基因的表达水平分析
试验方法同4.1.4.3，线粒体电子传递链相关基因引物列表见附录2。
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