试验方法：超低温保存技术测定H2O2含量的超氧化物歧化酶活性

4.1.4.1　ROS组分及抗氧化相关生理生化指标测定

样品匀浆液制备：称取0.2 g百子莲EC超低温保存不同阶段样品，在预冷的研钵中加入1.8 m L的0.1 mol/L磷酸缓冲液（p H 7.4）冰上研磨成浆，4℃下5000 rpm离心10 min，取上清液待测。

可溶性蛋白含量的测定应用考马斯亮蓝G-250法。

考马斯亮蓝G-250溶液配制：称取100 mg考马斯亮蓝G-250，溶于50 m L 90%乙醇中，加入100 m L 85%（w/v）磷酸，蒸馏水定容至1 L，贮于棕色瓶中。

标准蛋白质溶液（100μg/m L牛血清白蛋白）配制：称取牛血清白蛋白25 mg，加水溶解并定容至50 m L，吸取上述溶液20 m L用蒸馏水稀释至100 m L。

标准曲线绘制：取6只10 m L离心管，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 m L标准蛋白溶液，并用水定容至1 m L。混匀后各加入5 m L考马斯亮蓝G-250溶液，放置5 min后在595 nm下比色。以蛋白质浓度为横坐标，以吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。标准曲线为A=0.0 066B+0.039（R 2=0.9 879）。

测定：取上清液0.1 m L于10 m L离心管中，加入0.9 m L双蒸水稀释并混匀，加入5 m L考马斯亮蓝G-250溶液，充分混合，放置2 min后于595 nm下测定吸光度，并通过标准曲线查得可溶性蛋白质含量。

C——标准曲线值（μg）

V t——提取液总体积（m L）

W f——样品鲜重（g）

V s——测定时加样量（m L）

4.1.4.1.1　过氧化氢（H2 O2）含量的测定

按照测试盒说明书配制H 2 O2标准液后按操作步骤添加试剂，具体操作步骤如表4-1所示。

表4-1　过氧化氢（H2 O2）含量试剂盒操作步骤

混匀，波长405 nm，光径1 cm，双蒸水调零，测定各管吸光度值。试剂要37℃预温10 min。计算公式如下，H2 O2标准液浓度为163μmol/L。

H 2 O2含量（μmol/gprot）=×标准品浓度+待测样本蛋白浓度（gprot/L）

4.1.4.1.2　超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定

按照说明书配制试剂一应用液、试剂四应用液及显色剂，按表4-2所示的操作步骤进行实验。

表4-2　超氧化物歧化酶（SOD）活性试剂盒操作步骤

涡旋混匀，室温静置10 min。于波长550 nm，1 cm光径，双蒸水调零，测定各管吸光度值。计算公式如下：

SOD活性（U/mgprot）=÷待测样本蛋白浓度（mgprot/m L）

4.1.4.1.3　过氧化物酶（POD）活性测定

按照说明书配制试剂二应用液、试剂三应用液。按表4-3所示步骤添加试剂。

表4-3　过氧化物酶（POD）活性试剂盒操作步骤

混匀，5 000 r/min离心10 min，取上清于波长420 nm，1 cm光径，双蒸水调零，测定各管吸光度值。计算公式如下：

POD活力（U/mgprot）=÷反应时间÷待测样本蛋白浓度（mgprot/L）×1 000

4.1.4.1.4　过氧化氢酶（CAT）活性的测定

按照说明书配制试剂三，按表4-4所示步骤添加试剂。

表4-4　过氧化氢酶（CAT）活性试剂盒操作步骤

（续表）

混匀，波长405 nm，光径0.5 cm，双蒸水调零，测定各管吸光度值。试剂一、试剂二需要在37℃水浴中预温5 min。计算公式如下：

CAT活力（U/mgprot）=（对照OD值-测定OD值）×271×÷待测样品蛋白浓度（mgprot/m L）

4.1.4.1.5　抗坏血酸（AsA）含量的测定

按照试剂盒说明书配制试剂一应用液、试剂二应用液、试剂三应用液、试剂四应用液及6μg/m L的VC标准品应用液。取0.15 m L样品匀浆液加入0.45 m L试剂一，涡旋混匀，放置15 min后5 000 r/min离心10 min，取上清液进行测定。按表4-5所示步骤添加试剂。

表4-5　抗坏血酸（AsA）含量试剂盒操作步骤

充分混匀，静置10 min，波长536 nm，光径1 cm，双蒸水调零，测定各管吸光度值。计算公式如下：

VC含量（μg/mgprot）=×标准品浓度×4÷待测匀浆蛋白浓度（mgprot/m L）

4.1.4.1.6　还原型谷胱甘肽（GSH）含量的测定

按照试剂盒说明书，配制试剂一应用液、试剂二、试剂三、试剂四及20 μmol/L的GSH标准液。取0.5 m L样本匀浆液加入2 m L试剂一，混匀后5 000 r/mim离心10 min，取上清液进行测定。按表4-6所示步骤添加试剂。

表4-6　还原型谷胱甘肽（GSH）含量试剂盒操作步骤

混匀，静置5 min，420 nm处，1 cm光径，双蒸水调零，测定各管吸光度。

计算公式如下：

GSH含量（mg GSH/gprot）=×标准品浓度×307×5÷待测匀浆蛋白浓度（gprot/L）

4.1.4.2　碳纳米管对超低温保存过程中氧化胁迫损伤的影响

4.1.4.2.1　丙二醛（MDA）含量的测定

按照说明书指导，配制试剂二应用液和试剂三应用液。按表4-7所示步骤添加试剂。

表4-7　丙二醛（MDA）测定试剂盒操作步骤

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旋涡混匀器混匀，试管口用保鲜膜扎紧防止加热时液体蒸发损失，95℃水浴（或用锅开盖煮沸）80 min，取出后流水冷却，然后5 000 r/min，离心10 min，取上清液，532 nm处，1 cm光径，双蒸水调零，测定各管吸光度值。计算公式如下。

MDA含量（nmol/mgprot）=×标准品浓度÷待测样品蛋白浓度（mgprot/m L）

4.1.4.2.2　相对电导率测定

取0.2 g百子莲EC样品，用去离子水冲洗后吸干水分，将吸干的样品放入100 m L烧杯中，加入40 m L去离子水，25℃浸泡两小时后，用电导率仪测定电导率R；用保鲜膜封口，沸水浴15 min，冷却至25℃，摇匀，测定电导率R 0。

4.1.4.3　氧化胁迫响应相关基因的表达水平分析

4.1.4.3.1　RNA提取与纯化

1）RNA提取

（1）取0.1 g百子莲EC置于研钵中，加入液氮研磨至粉末状，立即加入600μL Buffer RL，快速研磨使Buffer RL覆盖样品；室温放置至样品开始融化后立即快速研磨至样品完全融化；将1 m L枪头剪掉1～2 mm，吸取550μL溶液转入事先置于2 m L离心管内的预过滤柱-RD。

（2）7 000 g离心30 s，丢弃预过滤柱-RD。

（3）在上一步的滤液中加入300μL Buffer RBP；用试剂盒携带的1 m L枪头缓慢吹吸五次，吸取全部溶液；将1 m L枪头紧插在过滤枪头，缓慢吹打使溶液滤过滴入事先置于收集管中的RNA吸附柱-A。

（4）12 000 g离心2 min，弃废液，将RNA吸附柱-A放回收集管中。

（5）加入500μL Buffer WAR，12 000 g离心1 min，弃收集管，将RNA吸附柱-A放入另一个干净的收集管中。

（6）加入500μL Buf fer WD，12 000 g离心1 min，弃废液，将RNA吸附柱-A放回收集管中。

（7）加入700μL Buffer RW2，12 000 g离心1 min，弃废液，将RNA吸附柱-A放回收集管中。

（8）加入100μL无水乙醇，离心2 min。

（9）将RNA吸附柱-A转入试剂盒携带的1.5 m L离心管中，在硅胶模中央加15μL dd H 2 O，离心1 min。

2）RNA完整性及质量检测

取5μL RNA样品加入含1%琼脂糖的凝胶中电泳分析，电泳缓冲液为1×TAE，120 V电泳30 min，检测RNA的带型，观察RNA的完整性。另取1μL RNA样品，用Nano Drop 1 000微量紫外分光光度计检测RNA浓度和质量。

3）总RNA纯化

为防止基因组DNA和蛋白质、盐类物质影响后续试验结果，建立RNA纯化体系（见表4-8）。

表4-8　RNA纯化体系配制

（续表）

（1）在1.5 m L的RNase-free离心管中加入上述反应体系，混匀后在37℃中水浴30 min。

（2）加入50μL RNase-free水将体系定容至100μL，然后加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25∶24∶1），混匀。

（3）室温下，13 500 g离心5 min，将上清液小心地移至新管中。

（4）加入等体积的氯仿/异戊醇（24∶1），混匀。

（5）室温下，13 500 g离心5 min，将上清液小心地移至新管中。

（6）加入10μL 3 mol/L醋酸钠和250μL预冷的乙醇，冰上放置10 min。

（7）13，500 g 4℃离心15 min，弃上清。

（8）加入70%预冷的乙醇小心洗净沉淀及管壁，13 500 g 4℃离心5 min，弃上清。

（9）室温干燥沉淀5 min，加入适量65℃预热的RNase-free水溶解沉淀，待RNA沉淀完全溶解后于-80℃保存待用。

4）RNA完整性及质量检测

取5μL RNA样品加入到含1%琼脂糖的凝胶中电泳分析，电泳缓冲液为1×TAE，120 V电泳30 min，检测RNA的带型，观察RNA的完整性。另取1μL RNA样品，用Nano Drop 1 000微量紫外分光光度计检测RNA浓度和质量。

4.1.4.3.2　c DNA制备

在进行c DNA合成反应前，将纯化后的RNA溶液于65℃水浴加热5 min后迅速置于冰中2 min。

（1）在微量离心管中配制反应液，如表4-9a所示。

（2）离心数秒使模版RNA、引物等的混合液聚集于微量离心管底部。

（3）在微量离心管中配制逆转录反应液，如表4-9b所示。

（4）混合均匀，室温放置10 min后，移至42℃恒温水浴中反应1 h。反应结束后在70℃水浴加热10 min，并放置于冰上冷却2 min，-20℃保存待用。

表4-9a　反转录体系配制

表4-9b　反转录体系配制

4.1.4.3.3　定量分析氧化胁迫相关基因的q RT-PCR差异表达

1）引物设计与合成

百子莲基因序列目前没有文献报道可以参考，根据本实验室百子莲转录组分析结果，通过NCBI网站的UniGene数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/unigene）进行基因比对及匹配，选取保守序列区域，并结合Beacon Designer 7.0软件设计目标基因引物，引物列表如附录1所示。

利用Beacon Designer 7.0软件进行引物设计，选取80分以上的引物对并进行合成。合成的引物首先进行PCR扩增检测扩增效果，并利用实时荧光定量PCR检测引物特异性及目的基因扩增效率。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

2）反应体系及程序

q RT-PCR扩增体系中包括：稀释25倍的c DNA原液为模板，SYBR Premix EX Taq II（2×）10μL，Forward Primer（10μmol/L）0.5μL，Reverse Primer（10μmol/L）0.5μL，dd H 2 O补齐至20μL，每个体系重复3次。反应程序为94℃变性3min，然后PCR扩增40个循环，每个循环包含94℃变性30 s，解链温度Tm复性30 s，72℃延长1 min。

3）数据分析方法

以Actin作为内参基因，以3次重复的几何平均值作为参照值。基因表达量的值应用2-ΔΔCt计算。其中ΔΔCt=Δ[（Ct 1-Ct 0）treated-（Ct 1-Ct 0）control]（1代表目标基因，0代表内参基因）。