百子莲离体细胞超低温保存技术-EC超微结构观察

3.2.2.1　百子莲EC正常继代培养细胞的超微结构

电镜观察结果如图3-2所示：百子莲EC细胞显示出清晰的细胞结构，细胞含有多个大小不一的液泡，一个大液泡占据了细胞的大部分空间，小体积液泡较少（见图3-2，a1）。细胞的质膜结构清晰完整，细胞膜紧贴细胞壁。细胞内各细胞器完好，线粒体、高尔基体、内质网呈现出正常的细胞器结构，其中线粒体的数量最多，线粒体的膜结构和内脊清晰可见（见图3-2，a2-a4）。细胞中可见包含淀粉粒的淀粉体和脂质体（见图3-2，a3-a4）。以上观察说明这是一个细胞结构完整、代谢正常的百子莲EC细胞。

3.2.2.2　百子莲EC低温-高渗预处理后的超微结构

高渗培养基对百子莲EC进行预培养，可以诱导细胞脱出部分自由水，提高细胞的抗冻能力。在0.5 mol/L蔗糖的MS固体培养基上，4℃条件下预培养2 d后，百子莲EC细胞超微结构出现了一些变化，观察结果如图3-3所示：细胞发生了质壁分离，但细胞膜质结构完整，大部分细胞质壁分离程度轻微，小部分质壁分离严重的细胞，在细胞壁与细胞质之间产生了较大明显的空腔（见图3-3，b1-b2）。细胞内大液泡变小，小液泡增多。与对照相比较细胞中细胞器不同程度的皱缩，高尔基体和内质网结构变化明显，线粒体为数量最多的细胞器，与对照处理相比，线粒体数量增多，多数线粒体紧贴细胞膜内侧排列分布（见图3-3，b2）。线粒体、高尔基体和内质网等细胞器发生了不同程度的皱缩现象，细胞内大淀粉粒变小，小淀粉粒增多（见图3-3，b3-b4）。

图3-2　百子莲EC正常继代培养细胞的超微结构观察

CW：细胞壁；ER：内质网；G：高尔基体；LB：脂质体；M：线粒体；SG：淀粉粒；V：液泡

图3-3　预培养后百子莲EC细胞的超微结构观察

CW：细胞壁；ER：内质网；G：高尔基体；LB：脂质体；M：线粒体；SG：淀粉粒；V：液泡

3.2.2.3　百子莲EC脱水处理后的超微结构

百子莲EC经过玻璃化溶液脱水处理后，细胞进一步脱水，质壁分离变得更加明显，原生质体严重收缩，细胞膜出现了皱褶，但细胞结构仍较完整（见图3-4，c1）。细胞质膜表面有不规则突起，产生空泡现象，小液泡数量增多，淀粉粒大多数破裂，小淀粉粒数量增多（见图3-4，c2）。细胞中高尔基体和内质网等细胞器普遍遭到破裂，线粒体膨大并出现空泡化，部分线粒体的内脊消失，内部小泡化基质稀薄化现象明显（见图3-4，c3）。细胞中具有多层膜结构的囊泡出现（见图3-4，c4）。从结构上看，百子莲EC细胞在脱水处理后已经受到一定的伤害。

图3-4　脱水处理后百子莲EC细胞的超微结构观察(www.xing528.com)

M：线粒体；SG：淀粉粒；VES：囊泡

3.2.2.4　百子莲EC洗涤后的超微结构

百子莲EC经过液氮保存解冻并洗涤后，细胞质壁分离复原，部分细胞仍有轻微的质壁分离（见图3-5，d1-d3）。线粒体的膨大和基质稀少已等到缓解，细胞中出现了较大的液泡。大部分细胞缺少膜结构，质膜破裂或者变得不平整，细胞内容物瓦解，有纤维状的物质，可能是细胞器解体后留下的碎片，淀粉粒体积由大变小，大量囊泡和脂质体贴细胞膜分布，说明这些细胞在处理过程中质膜结构遭到损伤，发生的损伤不可逆，遭到了致死伤害（见图3-5，d3-d4）。

图3-5　洗涤处理后百子莲EC细胞的超微结构观察

CW：细胞壁；LB：脂质体；M：线粒体；N：细胞核；SG：淀粉粒；V：液泡；VES：囊泡

3.2.2.5　CNT-PVS2超低温保存体系中百子莲EC脱水处理后的超微结构

相比拉曼光谱分析，TEM可以更加准确地看出CNT在胞内的分布，CNT-PVS2超低温保存体系脱水处理后的EC超微结构观察可以看出，CNT主要分布在细胞壁附近，并有部分CNT聚集在囊泡内（见图3-6）。相比于未添加CNT的体系，EC保持了更加完整的细胞结构。Villagarcia等（2011）提出碳纳米管可能作为仿生水通道，或调控已有水通道蛋白表达来调节水分的渗透和运输，水分渗透主要发生在细胞壁和细胞膜上。CNTPVS2超低温保存体系中预培养、渗透保护、脱水和洗涤过程均伴随着水分渗透的发生，保存材料的超微结构观察也发现CNT主要分布在细胞壁和细胞膜附近。

图3-6　CNT-PVS2超低温保存体系脱水处理后百子莲EC细胞的超微结构观察

CNT：单壁碳纳米管；VES：囊泡

3.2.2.6　CNT-PVS2超低温保存体系中百子莲EC洗涤处理后的超微结构

在CNT-PVS2超低温保存体系洗涤处理后的EC超微结构观察可以看出CNT主要分布更为稀少，观察多个重复样品的多个视野才能看到CNT的分布，说明经过洗涤处理，部分CNT洗出了EC细胞，留存的CNT多呈管状碎片状，主要分布在胞质和囊泡内（见图3-7），相比于未添加CNT的体系，EC保持了较为完整的细胞结构。拉曼光谱分析中发现，CNT信号在脱水和解冻后较强，而洗涤后信号则相对有所减弱，可能是洗涤过程使部分CNT移出细胞。CNT-PVS2超低温保存体系EC超微结构观察证实了这一点，洗涤后EC中的CNT明显少于脱水后。