百子莲离体细胞超低温保存方法简介

3.1.4.1　拉曼光谱分析

将样品收集于载玻片上，自然风干。使用色散型共聚焦拉曼光谱仪（Senterra R200-L）进行检测。所使用的激发器波长为785 nm，激光功率为100 m W，曝光时间为20 s，随机检测3个区域，取平均后生成一张谱图。原始光谱数据经拉曼光谱仪自带OPUS软件作图，不做平滑等其他数据处理。

3.1.4.2　透射电镜观察

3.1.4.2.1　样品的固定与包埋

（1）戊二醛前固定：分别称取0.2 g超低温保存各部处理后的百子莲EC，迅速投入3%戊二醛（0.1 M，p H7.0磷酸缓冲液配制）固定液中，置于4℃冰箱中固定6 h。

（2）清洗：用磷酸缓冲液（0.1 M，p H7.0）清洗3～4次，每次清洗30 min。

（3）锇酸后固定：将磷酸缓冲液清洗过的材料转移至2%四氧化锇固定液中，4℃下固定过夜。(www.xing528.com)

（4）清洗：后固定结束后，先用磷酸缓冲液（0.1 M，p H7.0）洗涤3～4次，再用重蒸水洗涤2～3次，每次洗涤30 min。

（5）脱水：逐级梯度乙醇脱水，50%乙醇脱水15 min，70%乙醇含2%醋酸双氧铀染色过夜，70%乙醇4℃冰箱中脱水10 min，90%乙醇4℃冰箱中脱水15 min。丙酮脱水，先用90%丙酮∶90%乙醇=1∶1 4℃冰箱中脱水20 min，90%丙酮（无水乙醇配置）4℃冰箱中脱水20 min，再用100%丙酮脱水3次，室温下脱水时间20 min。醋酸双氧铀染色液：醋酸双氧铀2 g，50%乙醇100 m L。

（6）渗透包埋：用包埋剂逐步取代脱水剂。用1∶1的丙酮和812环氧树脂（v/v）处理3 h后，再用1∶2的丙酮和812环氧树脂处理过夜，最后用纯树脂处理2次时间为4 h。

（7）聚合：将包埋好的材料放进恒温箱中，37℃过夜处理，45℃聚合12 h，60℃聚合48 h。

3.1.4.2.2　透射电镜观察

利用超薄切片机将包埋块切成厚度为70 nm的超薄切片，再切片移到覆有薄膜的铜网中备用。用柠檬酸铅染色液染色6 min，柠檬酸铅染色液组成为：硝酸铅1.33 g，柠檬酸钠1.76 g，蒸馏水30 m L，1N氢氧化钠8 m L，p H值12。用120KV生物型透射电镜（FEI，美国）观察、拍照。