百子莲种质资源离体繁殖研究成果

目前，国外对百子莲的研究多集中在分类学、生物化学、药效成分分析及分子育种等方面，而我国对百子莲的研究起步较晚，于2002年引进一个常绿亚种，在上海、广西、广州、哈尔滨等地已有栽培，但受积温影响多数不结果或种子不能萌芽（张荻，2011）。因此，生产上多采用分株方法进行种苗繁殖，但是繁殖速度慢，生长态势不一致。而通过组织培养和体细胞胚胎发生的方法则可大大加快百子莲的繁殖速度，从而缩短繁育的周期。

Suzuki等（2002）以百子莲幼叶为外植体，在含有1.0 mg/L毒莠定（picloram，PIC）的MS诱导培养基上，愈伤组织的诱导率为32.6%，培养两个月后24.8%的愈伤组织转化为胚性愈伤组织（embryogenic callus，EC），在成熟胚诱导培养基上EC转化为体胚，并且获得再生体胚苗。刘芳伊等（2011）用去根的百子莲无菌苗为外植体，在含有6-BA和NAA的MS培养基上，不定芽分化率达到了92%；在0.5 mg/L IAA的1/2MS的培养基上，生根率达到了80%。胡仲义和何月秋（2011）以花蕾作为外植体，在添加4.0 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA的MS培养基上成功诱导出不定芽，在添加2.0 mg/L 6-BA和0.2 mg/L NAA+GA3的MS培养基上增殖数可达5.07倍，同时在添加0.1 mg/L NAA+0.1 g/L活性炭的1/2MS培养基上生根率达到100%。范现丽（2009）以百子莲根茎顶端作为外植体，在含有0.5 mg/L PIC的MS培养基上成功诱导出愈伤组织，诱导率为53.33%，体细胞再生植株移栽成活率高达96%，建立了百子莲体胚快速繁殖体系。

百子莲愈伤组织呈现半透明状，细胞排布较为紧密；在1.5 mg/L PIC诱导下形成状态均一、疏松的颗粒状EC。通过切片观察细胞形态，愈伤组织细胞较大，细胞直径200～300μm，细胞核较小，胞内富含多糖类物质；EC细胞致密、细胞直径在15～30μm之间，较愈伤组织小15～20倍，细胞核染色很深、细胞排列紧密并具备一定的极性结构（见图1-4）。

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图1-4　百子莲愈伤组织和胚性愈伤组织细胞形态结构观察（张洁，2015）

a百子莲愈伤组织；b百子莲胚性愈伤组织；（1）（2）解剖镜观察；（3）切片番红染色显微观察

胚性愈伤组织是植物快速繁殖、分子育种与种质保存的重要材料。然而EC在含有高浓度的2，4-D、6-BA和PIC的增殖培养基上长期继代会导致染色体变异和基因突变，引起细胞胚性的退化与丧失，增加遗传的不稳定性，这也是植物体胚发生中一个普遍存在的问题。因此，建立一套稳定、高效的百子莲胚性愈伤组织超低温保存体系是保存百子莲种质资源的最佳方法。