植物超低温保存过程中次生伤害-氧化胁迫及其改善研究

大气中的O2获得不同数目的电子被激发后发生不完全氧化生成活性氧簇（reactive oxygen species，ROS），包括超氧阴离子自由基（O2-）、过氧化氢（H 2 O2）、羟自由基（OH·）和单线态氧（1 O2）。在已有的植物超低温保存逆境应答研究中发现，ROS诱导的氧化胁迫是超低温保存中导致细胞死亡的主要原因。这些氧化胁迫主要导致膜脂过氧化、蛋白变性、核酸的改变、膜损伤及严重的细胞混乱等（Halliwell和Whiteman，2004；Halliwell，2006），其中膜脂是ROS攻击的首要目标，丙二醛（malondialdehyde，MDA）是常见的氧化应激标志物。油菜茎尖、胡萝卜（Daucus carota）和水稻（Oryza sativa）悬浮细胞超低温保存中1 O2的积累参与到解冻后的伤害中（Benson和Withers，1987；Benson和Noronhadutra，1988；Benson et al.，1992），其中在胡萝卜和水稻超低温保存过程中，特别是快速化冻至恢复培养初期MDA含量提高表明膜脂过氧化是主要的逆境伤害。印楝（Azadirachta indica）种子超低温保存后恢复生长率也与MDA含量成负相关（-0.92）（Varghese和Naithani，2008）。Fang等证实OH·和膜脂过氧化是引起超低温保存体可可（Theobroma cacao）细胞胚活力丧失的主要原因（Fang et al.，2008）。Wen等超低温保存玉米（Zea mays）授粉35 d后的胚胎（Wen et al.，2010）和蒲葵（Livistona chinensis）开花后42周的离体胚（Wen et al.，2012）时发现，脱水和冷冻使谷胱甘肽还原酶（GR）活性下降，促进细胞膜脂过氧化，并引起MDA含量增加。吴元玲也证实大苞鞘石斛（Dendrobium wardianum）类原球茎超低温过程中PVS脱水后MDA含量骤然升高，与对照相比增加了31.5倍，且与原球茎冻后相对存活率TTC值具有极显著负相关性（-0.992）（吴元玲，2011）。

在超低温保存中，高水平的内源抗氧化剂和高效清除ROS的方法对植物超低温保存后的恢复至关重要（Storey，2006；Johnston et al.，2007；Margesin et al.，2007；Volk，2010）。抗冻型欧洲醋栗（Ribes reclinatum）茎尖在超低温保存过程中产生大量的抗氧化物质、花青素（anthocyanidin）、高的羟基活性和酚醛积累，恢复生长率较高（Johnston et al.，2007）。将橄榄（Canarium album）体细胞胚超低温保存前预培养3 d，内源抗氧化剂尤其是谷胱甘肽还原酶（GR）含量的增加可以提高恢复生长率（Lynch et al.，2011）。(www.xing528.com)

玻璃化法超低温保存相关的胁迫主要来自切割、渗透伤害、脱水和温度的改变，这些都会产生过量的ROS，并且ROS的合成和积累作为高毒性的活性化学物质主导着所有氧化应激反应，在超低温保存过程中形成氧化伤害，最终降低恢复生长率。