百子莲超低温保存:玻璃化法关键因素

在玻璃化法超低温保存中有多种因素影响最终保存效果，其中3个关键影响因素如下。

（1）保存材料的遗传类型及生理状态：一般来说，寒、温带植物较热带、亚热带植物更易于保存。材料状态方面，体积较小、细胞质浓，无液泡或小液泡、薄壁的细胞保存后才能存活；否则，细胞易受到伤害而影响成活率，尤其是热带、亚热带植物进行玻璃化法超低温保存，更应注意选择处于最佳生理状态的材料。

（2）预处理方法：通过适当的预处理方法（低温、高渗预培养和渗透保护）最大限度地减少细胞内的自由水含量，从而增强细胞的抗冻和耐脱水能力。目前应用最广泛的预培养方法是低温锻炼（cold acclimation）或在预培养基中加入诱导或提高抗寒性的物质，如糖、山梨醇、聚乙二醇、二甲基亚砜等。而渗透保护可以提高细胞渗透压，降低后续玻璃化溶液带来的渗透胁迫伤害（Sakai et al.，2008）。(www.xing528.com)

（3）玻璃化溶液处理：Volk和Walters认为玻璃化溶液有3个重要的功能，置换胞内自由水、改变胞内剩余自由水的结晶过程和防止过分脱水（Volk and Walters，2006）。玻璃化溶液可以提高细胞溶液的黏滞度，降低冰点温度，促进过冷却和玻璃化的形成，防止快速冷冻过程中冰晶造成的致命伤害（Sakai et al.，2008）。玻璃化溶液种类繁多，有单一型和混合型，如何选择一种适合保存材料的玻璃化溶液，以达到最大限度的保护作用非常重要，但同时PVS也会带来复合的逆境胁迫，例如渗透伤害和脱水胁迫（Uchendu et al.，2010）。因此，玻璃化溶液混合的比例、浓度、处理时间以及温度也是必须要考虑的因素。目前常用的PVS种类主要是Sakai团队发明的PVS1（22%w/v丙三醇+15%w/v乙二醇+15%w/v聚乙二醇+7%w/v二甲基亚砜Me2 SO+0.5 mol/L山梨醇的MS液体培养基）、PVS2（30%w/v丙三醇+15%w/v乙二醇+15%w/v Me2 SO+0.4 mol/L蔗糖的MS液体培养基）、PVS3（50%w/v丙三醇+50%w/v蔗糖的MS液体培养基）和PVS4（35%w/v丙三醇+20%w/v乙二醇+0.6 mol/L蔗糖的MS液体培养基）。