根瘤菌肥料：应用微生物学技术

根瘤菌和豆科植物之间的共生固氮在整个自然界生物固氮中具有重要作用。 根瘤菌属或慢生根瘤菌属的某些种感染豆科植物的根可以产生根瘤，并将氮气转变为氨。 目前世界上发现的豆科植物大约有2 000 种，大约有95%的种类具有形成根瘤的能力，与农业相关的豆科植物几乎都包含在内，如大豆、花生、豌豆、菜豆、苜蓿、三叶草、紫云英等。 不同种类的豆科植物和根瘤菌菌株之间存在明显的特异性，一种根瘤菌株一般只能感染豆科植物的某一个种，而不能感染其他种。 豆科植物与根瘤菌的共生固氮在农业上具有重要作用，它可以导致土壤中化合态氨的大量增加，促进植物的生长。

根瘤菌肥料是含有大量根瘤的活菌体的生物制剂，接种于豆科植物种子上，在土壤条件适宜时，根瘤菌能在豆科植物根际进行活跃的生命活动，并侵入豆科植物根部结瘤，固定空气中的氮素。 根瘤菌肥料应用于农业、牧业已有100 多年的历史，是应用历史最长、研究最深、效果最显著的一种生物肥料，目前对根瘤菌多样性的调查和利用是各国研究的热点。 在科研和生产中，根瘤菌株的选育有两种趋势:一是选择广谱性的根瘤菌，这些菌株可以在多种豆科植物上结瘤和固氮；二是选育高度特异性的菌株，这些菌株只在某些特定的豆科植物根部结瘤和固氮，而抑制其他固氮能力较弱的菌株结瘤。

1)根瘤菌的生物学特性

（1）根瘤菌的形态特征

根瘤菌为短杆状、革兰氏阴性菌，因生活环境和发育阶段不同，在形态上有显著变化。 根瘤菌在固体培养基和土壤中呈杆状，端生或周生鞭毛，能运动，无芽孢，培养较久，菌体粗大，细胞内常含有许多聚β-羟基丁酸颗粒，使细胞染色不均匀；根瘤菌侵染豆科植物的根部后，形态逐渐发生变化，进入根内时为短小杆状，随着根瘤的发育，菌体逐渐变大，为粗杆状或球状，有时一端膨大或分叉为梨形、棒槌形、茄子状、T 形或Y 形的类菌体。 根瘤菌腐败后，类菌体散入土壤中，崩解成小球状菌体，最后又发育成有鞭毛的短杆状菌，进行分裂繁殖。

（2）根瘤菌的培养特性

根瘤菌是化能异养型微生物，好氧，人工培养时需供应碳素、氮素、矿质元素、维生素等全部营养物质，最适生长温度为25 ～28 ℃，最适pH 值为6.5 ～7.5。 在固体培养基表面，菌落呈圆形，边缘整齐。 有的菌落无色半透明（如豌豆、紫云英的根瘤菌），有的菌落呈乳白色、黏稠（如花生、大豆的根瘤菌）。 菌体不易被刚果红和结晶紫染色，在培养基上很容易与其他菌落区别开。 在液体培养基中，菌液湿浊，菌体稍有沉淀，不形成菌膜。 培养时间过久则在液面四周有胶黏状物质。

（3）根瘤菌的生长特性

根据在人工培养基上生长的速率，根瘤菌可分为快生和慢生两种类型。 快生型（如苜蓿、三叶草等根瘤菌）接种后2 天即可见菌落，4 ～5 天菌落达到最大，菌落胶黏物质多，较稀薄。慢生型（如大豆、花生、豌豆等根瘤菌）接种3 ～4 天才有菌落出现，7 ～10 天菌落达到最大，菌落胶黏物质少，较稠厚。 不论是快生型根瘤菌还是慢生型根瘤菌，若生长速率变快，则菌株的结瘤性往往不好，是菌种退化的表现。

（4）根瘤菌的感染性、专一性和有效性

根瘤菌能够进入豆科植物的根内繁殖，形成根瘤，具有感染性。 通常一种根瘤菌只能在特定的一种或几种豆科植物根部结瘤、固氮，一种或几种豆科植物只能允许某一种特定根瘤菌或几种根瘤菌在它的根部结瘤、固氮，这就是根瘤菌的专一性。 根据根瘤菌在豆科植物根上形成根瘤的专一性，构成了“互接种族”关系。 根瘤菌还具有固氮活性，能在根瘤中进行固氮作用，这就是根瘤菌的有效性。

2)根瘤的形成与根瘤菌肥料的生产

豆科植物在与根瘤菌的互作过程中形成根瘤，具体包括5 个阶段:第一阶段，植物和根瘤菌正确识别，细菌附着在植物根毛处；第二阶段，细菌形成一条感染线侵染根毛；第三阶段，细菌通过感染线进入主根；第四阶段，在植物细胞内形成变形的细菌细胞类菌体，开始固氮；第五阶段，植物和细菌继续分裂，形成成熟的根瘤。

根瘤菌类微生物肥料的剂型较多，包括固体粉剂、液体剂型、斜面培养物剂型、液体矿物油剂型及固体颗粒剂型等。 其中固体颗粒剂型比较常见，它是利用载体吸附发酵液制成的。 其生产工艺流程为:菌种活化→扩大培养→发酵培养→纯度检验→载体吸附。

（1）菌种活化

把保藏的菌种接种在根瘤菌斜面培养基上，温度25 ～28 ℃，培养2 ～4 天。

（2）扩大培养

将活化后的根瘤菌菌苔用无菌水洗下，接种到液体培养基上，温度28 ～30 ℃，培养2 ～3天。 每毫升菌液含菌数可达几十亿至上百亿个，并进行培养液纯度检验。

（3）发酵培养

将菌液接入发酵罐发酵。 如果发酵罐很大，可加一级种子罐和二级种子罐进行种子的扩大培养，之后进行发酵液纯度检验。

（4）载体吸附(www.xing528.com)

常用的吸附剂有草炭、蛭石两种。 草炭含有丰富的有机质，保水力强，疏松，不黏结成块，通气良好，在用作载体之前需要对草炭进行预处理（晒干、打碎、过筛、去杂、调整pH 值至中性、消毒）。 吸附要迅速，密封装袋，成品放阴凉干燥处保存。

培养根瘤菌常用的培养基组分为: K2HPO4 0.05%，MgSO4·7H2O 0.02%， NaCl 0.01%，酵母提取物0.06%，甘露醇1.0%。 培养周期随菌种而异。 例如，根瘤菌属菌种培养时间短，一般为48 ～72 小时；慢生根瘤菌属菌种培养时间稍长，一般为72 ～120 小时。 对于根瘤菌肥料制备来说，保持菌种生长阶段的稳定非常重要，一般应该利用处于生长稳定期的根瘤菌制备产品。

3)根瘤菌肥料成品的质量检测

（1）有效活菌量和杂菌检测

我国规定根瘤菌类肥料中根瘤菌的活菌数≥3 ×109 cfu/g，杂菌率不超过10% ～15%。

（2）含水量

固体根瘤菌类微生物肥料含水量为25% ～30%。 含水量的高低与载体颗粒大小有关，如果颗粒细度为60 ～80 目，则含水量不宜超过30%，否则容易结块。

（3）成品无害化指标

将蛔虫卵死亡率、大肠杆菌的菌数、重金属及其化合物含量等成品无害化指标控制在一定的范围内，否则容易对环境以及人体带来危害。

（4）pH 值

成品酸碱度应为中性，否则根瘤菌容易死亡，缩短肥料的有效期。

（5）有效期

一般固体剂型的有效期比液体剂型的有效期长。 国内规定固体剂型在20 ℃、通风、干燥条件下的有效期一般为6 ～8 个月，液体剂型不低于3 个月。

4)根瘤菌肥料的科学使用

①选择根瘤菌类肥料适用的豆科植物接种。

②将根瘤菌剂用凉水调成浆糊状，再把种子倒入拌匀，稍阴干即可撒播并覆土，宜在傍晚和阴天撒播。

③拌种时不与农药、过磷酸钙一起拌（会杀死根瘤菌），可与钙镁磷肥一起拌， 但应先拌菌、后拌钙镁磷肥。

④稻田水要放干晒1 ～2 天再播种，旱田要在下雨前后播，盖一薄层土。

⑤根瘤菌生长要求比较湿润和疏松的土壤，含水量以20% ～30%为宜。

⑥以磷增氮，在有效磷含量低的土壤中施用磷肥可提高根瘤菌的结瘤率。