微生物农药资源挖掘-《应用微生物学原理与技术》

具有农药活性的微生物农药资源广泛存在于自然界，如何快速进行微生物农药资源的挖掘与开发是微生物农药研究开发工作者面临的重要课题。

1)基于生物活性的微生物农药资源的常规筛选与高通量筛选

农药活性的筛选是农药开发的重要环节。 据报道，目前一个化学农药的开发需要的化合物数量为十万个左右，涉及大量的筛选工作，高通量筛选得到了广泛应用。 尽管微生物农药的研究开发投入相对较少，但其筛选工作相对化学农药的筛选更为复杂，难度更大。 生物测定是筛选高效生防微生物的有效手段。 微生物资源农药活性的筛选，通常选择一些农业生产上重要的病虫草害为靶标，而所选择的靶标必须要有一定的敏感性，并根据不同的开发目标建立不同的农药活性筛选模型与方法。 微生物资源的杀虫活性筛选多以容易获得或可以规模化饲养的害虫为靶标，如棉铃虫、小菜蛾、孑孓。 Fabre 等直接利用试虫筛选平板放线菌培养物的杀虫活性。 供试虫的质量对杀虫活性筛选的结果影响较大。 微生物农药资源的杀菌或抑菌活性的测定，多采用植物病原菌的菌丝或孢子，利用平板对峙法、孢子萌发抑制或抑菌圈法进行测定；而对于一些专性寄生菌的抑菌活性的筛选，则需要建立基于植物幼苗或组织的测定方法。

在进行具有农药活性的微生物资源的大规模筛选时，必须要建立具有高度敏感性、高选择性及高效率的筛选模型，并建立小型化、自动化的高通量筛选方法。 一般年筛选样品量达20 000 个以上可以称为高通量筛选。 在开展微生物资源农药活性高通量筛选时，必须要考虑所采用的靶标敏感性，一些微生物菌株所产生的活性化合物的量极低，如果所选择的靶标敏感度不高，可能会产生一些假阴性结果而导致活性资源的遗漏。 线虫适合于杀虫活性高通量筛选。 杀菌活性的高通量筛选，通常以常见植物病原真菌的孢子、菌丝体或细菌菌体为筛选靶标，测定微生物菌株或其代谢物对病原微生物生长或孢子萌发的抑制。 除草活性的高通量筛选主要利用小型植株（如拟南芥）、一些低等植物（如浮萍或藻类等），以及植物愈伤组织进行微生物资源除草活性的快速筛选。

2)基于活性化合物的微生物农药资源挖掘

在开展微生物源农药活性化合物筛选研究时，研究者经常会碰到已知的化合物或不感兴趣的化合物。 为了避免不必要的人力、物力及财力浪费，研究者应尽可能在研究早期对微生物粗提物中的化合物进行初步鉴别，排除其中的已知化合物或重复化合物。 快速筛选已知化合物或重复的活性化合物的化学方法主要包括薄层层析、液相色谱-紫外联用、液相色谱-质谱联用、液相色谱-核磁共振联用或多种分析方法的结合使用。 Zahner 等建立了一个基于薄层层析的微生物天然产物的快速筛选方法，并应用于微生物天然产物的筛选，大大提高了发现新的微生物天然产物的概率。 但是，基于薄层层析的化学筛选，依赖化合物库的数量，且分辨率不高，自动化水平不高，对未知化合物缺乏有效的鉴别手段。 随着仪器技术的进步，液相色谱、紫外检测器、质谱甚至核磁共振等成为天然产物研究的通用装备，利用现代仪器进行农药活性化合物的快速鉴别成为可能。

3)基于功能基因的微生物农药资源的挖掘

（1）基于PCR 的微生物农药资源挖掘

微生物农药资源的农药活性，与其所产生的特定酶、蛋白质或次生代谢产物相关。 采用PCR 可快速鉴别与农药活性相关的酶、蛋白质或次生代谢产物的生物合成基因，实现农药活性微生物资源的快速挖掘。 苏云金芽孢杆菌的主要杀虫剂活性成分为伴孢晶体蛋白，一般由位于质粒上的基因所编码，许多编码伴孢晶体蛋白的基因被鉴定。 利用对苏云金芽孢杆菌所产生的毒素蛋白基因的保守序列设计引物，研究者可直接利用PCR 进行苏云金芽孢杆菌杀虫晶体毒素蛋白基因的快速鉴别。 根据菌株的基因组成，就能预测菌株的杀虫活性，结合生物测定方法，可以快速进行高毒力菌株的筛选。(www.xing528.com)

微生物次生代谢产物的生物合成基因通常成簇排列。 目前研究较多的主要为聚酮类抗生素及非核糖体编码的肽类抗生素的生物合成，可利用PCR 对具有农药活性的微生物次生代谢产物进行快速鉴别。 Ju 等利用PCR 对10 000 株放线菌中含磷酸的天然产物生物合成的基因pepM 进行了盲筛，从中发现278 个阳性菌株，其中包括产生已知除草活性化合物磷霉素（fosfomycin）及磷酸酶（phosalacine）等的菌株。 通过基因筛选，尽管可以快速发现与农药活性相关的基因，但目标基因可能是沉默的，其产物并不表达，需要通过其他手段来激活或表达，其活性还需要生物测定来确定。

（2）基于功能基因组的微生物农药资源挖掘

随着测序技术的发展，基因组测序将会变得越来越容易。 通过对产生已知抗生素的微生物菌株的基因组分析，结合其他分析技术及沉默基因的诱导表达，有可能发现新的活性化合物。 Bi 等通过基因组挖掘，从苏云金芽孢杆菌的基因组中发现了新的对蛴螬具有高毒力的Vip1/Vip2 二元毒素及Cry8 毒素蛋白基因。 Maansson 等将代谢组学及基因组挖掘技术相结合，比较了13 个不同来源的假交替单胞菌（Pseudoalteromonas luteoviolacea）菌株的次生代谢产物合成潜力，并从中鉴定了一个吲哚霉素的生物合成基因簇。

利用基因组挖掘，所发现的微生物次生代谢产物的生物合成基因簇数量，大大超过采用常规手段所发现的微生物次生代谢产物数量，因此通过基因组挖掘有机会大大提升发现微生物来源的农药活性物质的潜力。

（3）基于宏基因组的微生物农药资源挖掘

宏基因组技术的应用使得未培养微生物的研究成为可能。 未培养微生物将进一步丰富微生物农药研究开发资源。 未培养微生物可能产生具有农药药活性的物质，如次生代谢产物、蛋白质、蛋白酶及几丁质酶等，通过对宏基因组文库的构建和农药活性的筛选，可能获得新的农药活性物质。 罗坤等从构建的西藏米拉山高寒草甸土壤宏基因组粘粒文库中筛选得到两个聚酮生物合成酶基因的阳性克隆，其中一个阳性克隆K99 对南方根结线虫表现出较好的活性。Brady 等从构建的土壤宏基因组柯斯质粒文库中筛选到的一个具有抗细菌作用的克隆中发现了13 个生物合成基因簇开放阅读框（open readig frame，ORF），该克隆可产生两个新的天然产物类群。 Gillespie 等从早期构建的一个宏基因组文库发现3 个产生深褐色色素的克隆，从其中的一个克隆中发现了两个具有广谱抗菌活性的抗生素turbomycin A 和turbomycin B。 赵志祥等利用温室黄瓜根线虫发生地的土壤构建了粘粒宏基因组文库，通过蛋白酶活性的筛选及以根结线虫为靶标进行生物测定，筛选到一个含有杀线虫蛋白酶活性的克隆，进一步的基因结构分析发现该蛋白酶为分泌型蛋白酶。

宏基因组中农药活性物质的挖掘，必须与快速高效的农药活性筛选方法相结合。 筛选技术的进步和筛选通量的提升必将推动基于宏基因组的未培养微生物所产生的新型农药活性物质的发现。