农用抗生素的应用-应用微生物学技术

农用抗生素指微生物生命活动过程中产生的，对各种微生物、昆虫、线虫、寄生虫等其他生物，能在很低浓度下显示特异药理作用的次级代谢产物。 细菌、放线菌、真菌等微生物均能产生农用抗生素，其中放线菌产生的农用抗生素最多。 农用抗生素通过抑制细胞壁合成、阻碍原生质膜功能、抑制细胞蛋白质合成、抑制核酸合成等方面发挥作用。

20 世纪40 年代随着医用抗生素的发展，将某些医用抗生素，如链霉素、土霉素、灰黄霉素等用于防治农作物病害，取得了一定的效果。 但学者认为抗生素作为农药使用，会导致耐药性菌株的增加，同时医用抗生素多是抗细菌的，而植物80%的病害是由真菌引起的，于是各国兴起农用抗生素的研究。 1961 年，日本开发了杀稻瘟菌素-S 用于防治稻瘟病，并大面积推广，是世界上第一个大规模生产的农用抗生素，它成功地取代了危害严重的有机汞制剂，是农用抗生素发展过程中的第一个里程碑。 20 世纪70 年代，日本又开发出有效霉素，以其高效、安全、经济代替化学农药有机砷制剂，此后相继开发出春雷霉素、多氧霉素等高效低毒无公害抗生素。

与化学农药相比，农用抗生素具有以下特点:结构复杂；活性高、用量小、选择性好；农用抗生素易被分解，无积累或残留；生产原料为淀粉、糖类等农产品，属于再生性能源；采用发酵工程生产，生产菌大多是土壤中的放线菌，也有真菌和细菌。 缺点是药效不稳定、成本高、持效期短（易被土壤微生物及紫外线分解），易出现抗药性菌株（高度选择性所致）。

1953 年，我国植物病理学家、中国农用抗生素学科创始人之一尹莘耘先生，自陕西泾阳苜蓿根际土壤中分离到5 406 菌株，开始防治棉花枯黄萎病的试验，拉开了我国农用抗生素研究的序幕，此后又陆续投产了农抗120、灭瘟素、春雷霉素、多抗霉素和井冈霉素、吩嗪类抗生素、聚酮类抗生素、多肽类抗生素、核苷类抗生素等品种。 20 世纪70 年代以来，一些具有防治昆虫、螨、动物寄生虫、除草和调节动植物生长功能的农用抗生素不断被研究开发，扩大了农用抗生素的应用领域。

1)近10 年来研发的微生物源农用抗生素

微生物源农用抗生素，因高效、绿色环保等特性而成为生物农药的主力品种。 积极筛选和开发新型微生物源农用抗生素，对推动生物农药的发展、促进我国农业生产具有十分重要的意义。 下面总结了近10 年来研发的新型微生物源农用抗生素。

（1）吩嗪类抗生素

吩嗪类抗生素是一类具有含氮杂环结构的次级代谢产物，假单胞菌属和链霉菌属是天然吩嗪类抗生素的主要生产者，吩嗪类抗生素因其广谱抑菌活性受到研究人员的广泛关注。 目前作为农用抗生素研究的主要有吩嗪-1-羧酸、吩嗪-1-甲酰胺、2-羟基吩嗪等。

①吩嗪-1-羧酸（phenazine-1-carboxylic acid，PCA）。 PCA 是一种黄色的吩嗪类化合物，在2011 年，由铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa M18 产生的PCA，被中国农业部批准为一种新型微生物源杀菌剂“申嗪霉素”，具有自主知识产权。 PCA 对水稻纹枯病、西瓜枯萎病、甜椒疫病、辣椒疫病及黄瓜枯萎病等具有良好的防治效果，但是PCA 的抗真菌活性受环境pH 的影响较大。

②吩嗪-1-甲酰胺（phenazine-1-carboxamide，PCN）。 PCN 可由绿针假单胞菌P. chlororaphis 和P. aeruginosa 等合成，PCN 对于尖孢镰刀菌、水稻黄单胞菌、立枯丝核菌、番茄镰刀菌及终极腐霉等多种植物病原真菌具有显著的拮抗作用。 在中性条件下，PCN 的抗真菌活性比PCA 高得多，因此PCN 能够适应不断变化的环境。

③2-羟基吩嗪（2-hydroxyphenazines，2-OH-PHZ）。 2-OH-PHZ 是由P. chlororaphis 30-84 和P.chlororaphis GP72 等绿针假单胞菌产生的一种吩嗪衍生物。 2-OH-PHZ 具有广谱杀菌性，能够有效防治小麦全蚀病，对疫霉、腐霉等植物病原真菌具有很好的抑制作用。

（2）聚酮类抗生素

①疏螺体素（borrelidin）。 疏螺体素为浅黄色晶体，是一种大环内酯类抗生素，分离自链霉菌属。 疏螺体素对于大豆疫霉菌、瓜果腐霉、终极腐霉以及辣椒疫霉等植物病原真菌具有显著的拮抗作用，其中疏螺体素对大豆疫霉菌具有很高的特异性抗真菌活性，10 mg/L 的疏螺体素对大豆疫霉菌的防治效果达94.72%，其防治效果显著高于甲霜灵。

②米尔贝霉素（milbemycins）。 米尔贝霉素是由链霉菌产生的一类十六元大环内酯类化合物，具有强效的抗虫和杀虫活性。 由冰城链霉菌Streptomyces bingchenggensis 产生的米尔贝霉素A3/A4 已被开发为防治农业螨虫的杀螨剂，米尔贝霉素A3/A4 的半合成衍生物米尔比霉素肟化物已经用于线虫、丝虫等害虫的防治，其他米尔贝霉素A3/A4 的衍生物如雷皮菌素和拉替菌素也已经广泛应用于农业领域。

③茴香霉素（anisomycin）。 茴香霉素是由玫瑰产色链霉菌S.roseochromogenes、刺孢吸水链霉菌北京变种S. hygrospinosus var. beijingensis、浅灰色链霉菌S. griseolus 等产生的一种吡咯烷类抗生素，是农抗120 中重要的有效成分之一，对其生物合成基因簇进行鉴定后通过发酵分离得到。 茴香霉素主要用于农作物真菌病害的防治，例如农作物白粉病、西瓜腐烂病、水稻纹枯病等。

（3）多肽类抗生素

①杆菌霉素D（bacillomycin D）。 杆菌霉素D 是由解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、枯草芽孢杆菌（B. subtitles）、贝莱斯芽孢杆菌（B. velezensis）等产生的一种环状抗真菌脂肽。 杆菌霉素D 可以有效抑制孢子萌发和菌丝体生长，对于黄曲霉、禾谷镰刀菌、炭疽菌、灰葡萄孢菌、匍枝根霉等具有很强的抑制活性。 杆菌霉素D 安全且易于降解，土壤中的杆菌霉素D 通过分解成为氨基酸残基，可以防止其积累达到有害水平。(www.xing528.com)

②恩拉霉素（enramycin）。 恩拉霉素最初是从杀真菌素链霉菌S. fungicidicus 中分离出来的一组脂肽抗生素，可以以甲醇为溶剂，并利用超声辅助进行分离提取。 恩拉霉素由17 个氨基酸组成，根据脂肪链长度的不同分为恩拉霉素A 和恩拉霉素B。 恩拉霉素是一种碱性抗生素，由于对于大多数革兰氏阳性菌具有很好的抑制活性，因此有望在农业中广泛应用。

（4）核苷类抗生素——新奥霉素（xinaomycin）

新奥霉素是由中国科学院成都生物研究所用遗传改良菌株“诺尔斯链霉菌Xi Ao-3”发酵生产的一种新型尿嘧啶核苷肽类抗生素，对疫霉菌、炭疽菌、棉花黄萎病菌、番茄花叶病毒以及西瓜花叶病毒具有很强的抑制活性。 新奥霉素作为一种新型广谱生物杀菌剂存在一定的缺陷，一是新奥霉素产品呈酸性，不适宜与碱性药剂混合使用；二是新奥霉素对紫外光线敏感，不宜在强日照下使用。

2)微生物源农用抗生素的高产育种新策略

不同用途的微生物源抗生素的高产育种方法基本相似，相关方法同样应用于农用抗生素的研发。 从自然界分离出来的野生型菌株所产生的抗生素含量一般很低，无法满足商业需求。工业微生物高产菌株选育的常用手段是采用化学或物理诱变、基因工程育种等。 传统的化学诱变、UV 诱变、放射诱变等仍是生物企业常用的育种手段，近年来常压室温等离子体（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）因安全、简便得到广泛应用。 随着微生物基因组学的发展，代谢工程技术及基因编辑技术的进步，基因工程育种已成为抗生素高产菌株获得的主要途径。

（1）新型诱变育种

近年来，ARTP 技术和重离子诱变技术被认为是有效和新颖的微生物诱变育种技术。 ARTP 的核心组件是RF ARGD 等离子体发生器，它产生的等离子体射流可以改变细胞壁和细胞质膜的结构和通透性，导致DNA 损伤，包括错义突变、核苷酸缺失或核苷酸移码突变等，与传统诱变育种方法相比，ARTP 具有突变速度快、操作灵活度高、安全高效等特点。 目前，ARTP技术已经成功应用于假单胞菌属和链霉菌属等高产菌株的选育，使得吩嗪-1-甲酰胺、阿维菌素和米尔贝霉素A3/A4 的产量有了较大的提升。

重离子诱变技术也是一种产生微生物突变体的有效方法。 相比传统的诱变方法，它可以产生更高的突变率和突变谱。 重离子诱变通过热和电离效应等直接造成微生物菌株的DNA损伤，这些DNA 损伤更加有利于微生物突变体的产生。 如通过利用兰州重离子加速器对链霉菌进行诱变育种，提高了恩拉霉素及阿维菌素的产量。

微生物进行诱变育种后需要对大量的菌株进行测试与筛选，传统的琼脂平板初步筛选、摇瓶发酵二次筛选和高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）验证产量的筛选过程非常耗时，因此在育种过程中需要建立简单快速的高通量筛选方法以有效获得阳性菌株。

在P. chlororaphis GP 72 中将2-OH-PHZ 合成途径中的限制性酶Phz O 替换为绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP），以GFP 作为筛选标记进行诱变育种，通过酶标仪检测荧光强度进行高通量筛选，在筛选出的突变株中通过Phz O 的回替2-OH-PHZ 的产量比野生型菌株提高4.62 倍。

新型诱变育种操作简单、突变率高，可在较短时间内获得优良的突变类型，但是诱变育种具有一定的盲目性与随机性，一般情况下产生的有益突变体频率低，而且后期突变菌株的筛选比较困难。

（2）基因工程育种

①利用代谢工程技术改造生产菌株。 负调控基因的敲除、正调控基因的过表达、分支途径的改造是基因工程育种的常用方法。 微生物代谢网络是一个复杂的系统，基因组学技术、生物信息学的快速发展和基因编辑技术的建立为微生物源农用抗生素的工业化生产创造了新的发展空间。 通过系统性筛选和代谢网络分析，抑制负调控途径或因子、扩增正调控途径或因子、加强产物运输系统、增强前体途径、操纵产物反馈机制以及消除竞争性代谢途径等方法，可以使微生物源农用抗生素的产量有较大的提升。

②利用底盘细胞构建高产菌株。 由于缺乏高效的遗传操作技术、生长速度慢、产量低或易受环境干扰等原因，许多天然微生物并不是抗生素等代谢产物的理想生产对象。 因此，在微生物底盘细胞中异源表达天然产物合成途径引起了越来越多的关注。 随着系统生物学和合成生物学工具在途径识别、预测和重构方面的发展，一些模式微生物，如大肠杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、链霉菌等，已被确定为异源表达和大规模生产高价值天然产物的理想底盘。 这些底盘细胞的优势在于生长速度较快，其基因组和代谢网络具有很透彻的研究，因此通过不同的合成生物学技术对其进行工程化处理，可以实现天然产物的高效表达。

③核糖体工程技术。 核糖体工程技术是利用核糖体蛋白结构上的突变对微生物次级代谢调控产生影响，进而进行微生物育种的一项技术，目前已成为激活与提高微生物多种重要次生代谢产物的主要技术。 向核糖体或RNA 聚合酶引入特定的抗生素抗性突变，使该菌株核糖体的特定基因发生突变，赋予目的菌株某种抗生素抗性，从而激活次级代谢产物合成，迅速提高抗生素产量。 相比经典的微生物育种方法，核糖体工程技术具有产量提高迅速、耗时少、基因突变位点明确且易于检测等优点，可以大幅度提高正向突变菌株的获得率。 另外，核糖体工程技术还适用于那些没有明确遗传背景的菌株改造。