水中病原微生物的浓缩和检测方法

1)病原微生物浓缩方法

通常情况下，水中的病原微生物浓度低，分散度大，因此在检测之前必须经过有效的浓缩富集。 原生动物和细菌的个体较大，浓缩较容易，使用孔径0.45 μm 或0.22 μm 的膜过滤或者高速离心就可达到目的；而病毒的体积十分微小，浓缩相对比较困难。 目前，水中病毒浓缩方法主要有以下几类。

（1）免疫捕获法

该法利用抗原-抗体反应的高度特异性来收集捕捉病毒。 由于病毒本身可作为抗原，根据免疫学反应可设计出针对病毒的抗体，通过抗原和抗体的特异性结合来达到浓缩病毒的方法，可以使用病毒特异性抗体来包被磁珠，进一步提高分离效率。 免疫捕获的方法还可以与后续的检测技术顺利衔接，例如IgM 抗体捕捉-ELISA，免疫-PCR 等。 但在实际应用中免疫捕获法并不多见，主要是由于水中的一些杂质可能会对抗原-抗体反应产生严重的干扰，此外该法操作复杂、成本高，也是这种技术推广普及的严重障碍。

（2）超离心法

超速离心法使用50 000 r/min 以上的转速，获得极大的离心力，从稀释悬浮液中浓缩病毒。 但这种方法需要使用昂贵的超速离心机，而且要求样品的体积很小，一般仅用于二次浓缩。

（3）沉淀法

通过向水体中加入某种具有絮凝性的化学物质，形成絮凝沉淀物，而病毒通过与沉淀物相结合达到浓缩目的。 絮凝剂主要分为无机絮凝剂和有机絮凝剂两种。 无机絮凝剂主要包括磷酸铝、氢氧化铝、氯化铝等易形成沉淀的无机物，而有机絮凝剂主要有聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）和鱼精蛋白硫酸盐等。 沉淀法虽然操作简便，但对于大体积水样的病毒浓缩效率并不高，因此一般只是用于洗脱液中病毒的二次浓缩。

（4）吸附-洗脱法

该法利用吸附剂来吸附大体积水样中的病毒，再用较小体积的洗脱剂将被吸附的病毒洗脱下来，可以几十倍甚至上百倍富集病毒。 聚合电解质、活性炭、玻璃纤维等都可以用作吸附剂。

从广义上来讲，膜吸附-洗脱法也属于吸附-洗脱法。 它结合了滤膜的机械截留作用和静电力作用，可以在小于病毒颗粒直径的膜孔径下实现对病毒的截留。 滤膜的材料种类繁多，有醋酸纤维、硝酸纤维、玻璃纤维、尼龙等，根据滤膜表面所带电荷的性质，可以分为正电荷滤膜和负电荷滤膜两大类。 滤器的形式主要有圆盘式和具有更大表面积的折叠筒式。 由于膜吸附-洗脱法的可操作性强，近年来发展迅速，现已成为应用最广泛的病毒浓缩方法之一。

2)病原微生物检测方法(www.xing528.com)

（1）经典检测方法

经典检测方法泛指基于微生物形态学和生化特性进行检测的方法。 例如利用显微镜观察并计数染色后的细菌；利用细菌或真菌对碳源利用能力的不同，采用选择性培养基进行区别和鉴定；利用特定宿主细胞培养病毒等。

这类方法的发展历史悠久，一般来说检测结果准确度较高，但操作较为烦琐。 近年来出现的各种自动生化鉴定仪，例如VITEK、BD-Phoenix 等，其原理也是以大规模生化试验为基础，利用各种试验结果组合成数字编码，与数据库进行比对从而得到鉴定结果。 全自动仪器不仅大大提高了检测效率，而且减少了人为操作造成的误差。 需要注意的是，对于环境样品中那些既无法进行人工培养又难以分离的一些病原微生物，这类方法就不适用了。

（2）免疫学检测方法

免疫学方法主要是利用抗原-抗体反应的高度特异性，免疫学方法在临床诊断中广泛用于检测特异性抗原或抗体的存在，其敏感性高、特异性强、操作简便。

酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是最常用的免疫学检测方法。 通过用酶标记抗原或抗体，抗原与抗体结合后加入底物出现显色反应来实现定性检测。单克隆抗体的制备成功大大提高了这种检测方法的特异性。 此外，采用聚酯布、磁性粒子、氧化钛膜等特殊材料制成的固相载体来结合抗体进行检测，不仅能够与浓缩富集过程顺利衔接，而且可大大提高灵敏度。

（3）分子生物学检测方法

随着分子生物学技术的迅速发展，PCR 技术、分子分型技术以及流式细胞技术已经越来越多地应用到病原微生物的检测方面，其中以PCR 技术的应用尤为广泛。

PCR 技术以其快速、灵敏、准确的特点，在病原微生物检测上的应用尤为广泛。 PCR 检测病原菌的靶序列主要来自编码毒素或抗原的基因，例如编码志贺菌外毒素的set 和sen 基因，以及编码侵袭性质粒相关抗原H 的片段ipaH、沙门菌属侵袭性抗原保守基因invA、霍乱肠毒素基因ctxA 等。 对于病毒而言，其靶序列主要位于非编码区和编码衣壳蛋白的基因区内。

为了解决病原微生物核酸定量的问题，在常规PCR 技术的基础上发展起来了实时荧光定量PCR 技术（real-time fluorescent quantitative PCR，Q-PCR）。 通过在PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号来实时监测整个PCR 进程，最后使用标准曲线对未知模板浓度进行定量分析，不仅实现了对核酸的定量检测，而且无须产物后续处理过程，有效减少了外源污染的风险。 这一技术在污水和地表水的病原微生物检测中应用得尤为广泛，国内外的学者对此做了大量研究，针对典型的肠道病毒、病原菌、原生动物等建立了很多实时荧光定量PCR 检测方法，为控制水环境病原微生物传播、保障污水安全再生回用提供了有力的检测手段。

为了进一步区分所测病原体的型别，分析其不同来源和进化变异特点，就需要采用分子分型技术。 目前常用的分子分型技术包括质粒酶切图谱（plasmid profile analysis，PPA）、限制性片段长度多态性分析（restriction fragment length poly-morphism，RFLP）、脉冲场凝胶电泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）等。 这些技术大都是与PCR 技术联用的，依赖文库比对来分析所测病原体的来源和进化变异特点。 PCR 技术的高效便捷使这些技术得到了充分应用。